BMDCs中Ad诱导IRF3磷酸化的表征
确认Ad感染可诱导BMDCs中IRF3磷酸化及其亚细胞分布。
用Ad转导野生型BMDCs，免疫印迹检测p-IRF3(S396)和IRF3，并分离核质组分检测IRF3分布。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
S6K-STING相互作用调控胞质DNA介导的转录因子IRF3活化
S6K-STING interaction regulates cytosolic DNA-mediated activation of the transcription factor IRF3.
实验完整度
高包含BMDCs体外模型、HEK293T细胞、基因敲除小鼠及DC免疫与HSV-1感染模型，并有功能与机制验证
主要模型
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs） HEK293T细胞 S6k1−/−S6k2−/−等基因敲除小鼠 Ad-OVA转导的DC免疫小鼠模型
重点核对
BMDCs基因型：野生型、S6k1−/−、S6k2−/−、S6k1−/−S6k2−/−、Irf3−/−、Tmem173−/−等 Ad感染MOI为100，VSV MOI为25，HSV-1 MOI为5 rapamycin预处理2小时，doxycycline诱导浓度1 μg/ml 免疫沉淀与免疫印迹检测STING、TBK1、IRF3及S6K1相互作用 体内DC免疫每足垫0.5×10^6细胞，VV-OVA挑战剂量10^7 pfu
摘要
胞质DNA介导的转录因子IRF3活化是宿主抗病毒反应中的关键事件。在此，我们证明DNA病毒感染以cGAS（cGAMP合成酶）依赖的方式诱导mTOR下游效应分子S6K1（S6激酶1）与信号接头蛋白STING的相互作用。我们进一步证明，S6K1的激酶结构域而非激酶功能是S6K1-STING相互作用所必需的，并且TBK1对该过程有重要促进作用。S6K1-STING-TBK1三元复合物的形成是IRF3活化所必需的，破坏该信号轴会损害IRF3靶基因的早期表达以及T细胞反应和黏膜抗病毒免疫的诱导。因此，我们的结果揭示了胞质DNA通路中IRF3活化的一种基本调控机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- S6K是否以及如何参与胞质DNA介导的STING-IRF3信号通路活化。
- 核心机制
- DNA病毒经cGAS-cGAMP激活STING后，S6K1以不依赖其激酶活性的方式与磷酸化STING结合，形成S6K1-STING-TBK1三元复合物，促进TBK1介导的IRF3磷酸化。
- 主要证据
- 在BMDCs中敲除S6K1/S6K2降低Ad、ISD、cGAMP诱导的IRF3磷酸化但不影响TBK1活化；免疫沉淀显示S6K1与STING互作依赖cGAS和TBK1；HEK293T细胞共转染及体外激酶实验证实三元复合物形成；体内DC免疫和HSV-1感染模型显示S6K依赖的IRF3信号影响T细胞反应和黏膜抗病毒防御。
- 研究意义
- 揭示了S6Ks在胞质DNA-cGAS-STING通路中调控IRF3活化的新功能，为理解IRF3信号网络及病毒转导DC疫苗的免疫效果提供了机制依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
S6K敲除对Ad诱导IRF3活化的影响
验证S6K1/S6K2是否参与Ad诱导的IRF3磷酸化和核转位。
在野生型、S6k1−/−、S6k2−/−、S6k1−/−S6k2−/−及4E-BP敲除BMDCs中转导Ad，免疫印迹和免疫荧光检测IRF3磷酸化及核转位。
S6K对Toll样受体和RIG-I通路IRF3活化的特异性
检验S6K是否特异性作用于胞质DNA通路而非LPS或VSV诱导的IRF3活化。
用LPS、VSV、纯化Ad DNA、ISD或cGAMP刺激野生型和S6k1−/−S6k2−/− BMDCs，免疫印迹检测IRF3磷酸化。
S6K激酶功能非依赖性验证
确定S6K的激酶活性是否为Ad诱导IRF3活化所必需。
用rapamycin预处理BMDCs或回补激酶失活突变体S6K1(K100R)，检测IRF3磷酸化。
STING-TBK1通路的上下游关系分析
明确S6K作用于STING-TBK1-IRF3轴的哪个环节。
在Myd88−/−Trif−/−、Mavs−/−、Tmem173−/−、Tbk1−/−及S6k1−/−S6k2−/− BMDCs中转导Ad，检测TBK1和IRF3磷酸化。
S6K对IRF3与STING结合的影响
验证S6K是否影响IRF3与STING的相互作用。
在野生型、S6k1−/−S6k2−/−、Irf3−/−和Tbk1−/− BMDCs中转导Ad，免疫共沉淀检测STING、TBK1和IRF3的相互作用。
S6K1-STING相互作用的生化和结构域定位
确定S6K1与STING的相互作用是否依赖cGAS、cGAMP及S6K1特定结构域。
在HEK293T细胞中共转染S6K1和STING野生型或突变体，以及cGAS shRNA敲低BMDCs，免疫共沉淀检测相互作用。
S6K1-STING-TBK1三元复合物的形成
验证TBK1介导的STING磷酸化是否促进S6K1-STING-TBK1三元复合物形成。
在HEK293T细胞中共转染S6K1、STING和TBK1野生型或激酶失活突变体，免疫共沉淀及体外激酶实验检测复合物。
体内DC免疫和抗病毒防御验证
评估S6K依赖的IRF3信号在体内T细胞反应和黏膜抗病毒免疫中的作用。
用Ad-OVA转导的野生型、S6k1−/−S6k2−/−或Irf3−/− BMDCs免疫小鼠，检测OVA特异性CD8+ T细胞和VV-OVA挑战；HSV-1阴道感染模型检测病毒复制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 重组鼠GM-CSF | PeproTech | -- |
| β-巯基乙醇 | Gibco | -- | |
| 病毒转导 | Ad-BHGdE1E3 | -- | -- |
| Ad-OVA | -- | -- | |
| VSV-ΔM51 | -- | -- | |
| HSV-1（KOS株） | -- | -- | |
| 刺激处理 | 脂多糖（大肠杆菌O111:B4） | Sigma | -- |
| 雷帕霉素 | Calbiochem | -- | |
| 小牛肠碱性磷酸酶 | New England Biolabs | -- | |
| 非经典2′,3′ cGAMP | BioLog | -- | |
| 质粒转染 | XtremeGENE HP DNA转染试剂 | Roche | -- |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- | |
| shRNA敲低 | TBK1 shRNA | Sigma | TRCN0000314840 |
| cGAS shRNA | Sigma | TRCN0000178625 | |
| 非靶向scrambled shRNA对照 | Sigma | SHC002 | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| 磷酸酶抑制剂混合物II和III | Sigma | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Santa Cruz | -- | |
| Odyssey封闭液 | Li-cor | -- | |
| Odyssey扫描仪 | Li-cor | -- | |
| 免疫共沉淀 | 蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物 | ThermoFisher Scientific | 78441 |
| 体外激酶实验 | HA标签蛋白纯化试剂盒 | MBL | 3320A |
| Flag标签蛋白纯化试剂盒 | MBL | 3325A | |
| 1×激酶缓冲液 | Cell Signaling Technology | 9802 | |
| ATP | Cell Signaling Technology | 9804 | |
| 兔抗S6K1抗体 | Millipore | 05-781R | |
| 抗兔IgG F(ab’)2片段琼脂糖珠 | Cell Signaling Technology | 3400 | |
| 流式细胞术 | 抗CD16/CD32抗体（克隆2.4G2） | BD Biosciences | 553142 |
| 抗CD3-APC-Cy7抗体（克隆145-2C11） | BD Biosciences | 557596 | |
| 抗CD8-PE抗体（克隆53-6.7） | BD Biosciences | 553033 | |
| 抗CD4-PerCP-Cy5.5抗体（克隆RM4-5） | eBioscience | 45-0042-82 | |
| 抗IFN-γ-APC抗体（克隆XMG1.2） | BD Biosciences | 554413 | |
| 抗TNF-α-FITC抗体（克隆MP6-XT22） | BD Biosciences | 554418 | |
| 布雷菲德菌素A（GolgiPlug） | BD Pharmingen | -- | |
| Cytofix/Cytoperm固定破膜试剂盒 | BD Pharmagen | -- | |
| CFSE | Sigma | -- | |
| 25-D1.16单克隆抗体 | eBioscience | 17-5743-80 | |
| PE-Cy7 CD11c抗体 | BD Biosciences | 558079 | |
| 免疫荧光 | 兔抗小鼠IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4302 |
| 荧光标记山羊抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | -- | |
| DAPI | Molecular Probes | -- | |
| LSM 510 META倒置共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| 免疫印迹 | IFIT1抗体 | abcam | ab11821 |
| 磷酸化TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3504 | |
| 磷酸化IRF3(S396)抗体 | Cell Signaling Technology | 4947 | |
| IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4302 | |
| STING抗体 | Cell Signaling Technology | 3337 | |
| STING抗体 | Cell Signaling Technology | 13647 | |
| p70S6K1抗体 | Cell Signaling Technology | 9202 | |
| 磷酸化p70S6K1(S371)抗体 | Cell Signaling Technology | 9208 | |
| 磷酸化p70S6K1(T389)抗体 | Cell Signaling Technology | 9234 | |
| 磷酸化S6核糖体蛋白(S240/244)抗体 | Cell Signaling Technology | 5364 | |
| S6K2抗体 | Cell Signaling Technology | 14130 | |
| MyD88抗体 | Cell Signaling Technology | 4283 | |
| IPS-1抗体 | Cell Signaling Technology | 4983 | |
| ISG15抗体 | Cell Signaling Technology | 2743 | |
| cGAS抗体 | Cell Signaling Technology | 31659 | |
| 免疫沉淀 | HA标签抗体-琼脂糖珠 | Cell Signaling Technology | 3956 |
| 免疫印迹 | HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 |
| HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2367 | |
| 免疫沉淀 | Flag标签抗体-琼脂糖珠 | Cell Signaling Technology | 5750 |
| 免疫印迹 | Flag标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2368 |
| Flag标签抗体 | Cell Signaling Technology | 8146 | |
| 免疫沉淀 | 抗兔IgG F(ab’)2片段琼脂糖珠 | Cell Signaling Technology | 3400 |
| 免疫印迹 | Myc标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 |
| GFP标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2956 | |
| cGAS抗体 | Abiocode | R-3252-1 | |
| IRF3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9082 | |
| IRF3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-15991 | |
| TBK1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9910 | |
| 组蛋白H1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10806 | |
| p70S6Kβ(S6K2)抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-9381 | |
| 兔抗山羊IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2768 | |
| HA探针 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7392 | |
| 免疫沉淀 | Myc标签抗体-琼脂糖珠 | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 AC |
| 免疫印迹 | 荧光素酶抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-74548 |
| β-actin抗体 | Sigma | A5441 | |
| p70S6K1抗体 | Millipore | 05-781R | |
| Trif抗体 | Novus Biologicals | NB-120-13810 | |
| IRF3抗体 | Zymed Laboratories | 51-3200 | |
| 抗Flag抗体 | Rockland Immunochemicals | 600-401-383 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BMDCs制备与Ad转导 | BMDCs来源小鼠基因型、GM-CSF浓度40 ng/ml、Ad MOI 100、转导时间 阅读提示：Methods中BMDCs preparation和Viruses, viral transduction小节 |
| S6K敲除与回补实验 | S6k1−/−S6k2−/− BMDCs回补S6K1(WT)或S6K1(K100R)的lentivirus感染时间、doxycycline浓度1 μg/ml诱导24小时、Ad感染24小时 阅读提示：Methods中Lentiviruses小节及Figure 2d图注 |
| 免疫共沉淀检测STING-S6K1-TBK1相互作用 | IP抗体种类、孵育时间1-3小时或过夜、细胞裂解液成分 阅读提示：Methods中Immunoblot and immunoprecipitation小节 |
| HEK293T细胞共转染与cGAMP刺激 | 质粒转染量、转染试剂XtremeGENE HP、cGAMP转染6小时 阅读提示：Methods中Expression constructs and transfection小节及Figure 5e图注 |
| 体内DC免疫与VV-OVA挑战 | 每足垫0.5×10^6 BMDCs、免疫后14天T细胞检测、第26天VV-OVA挑战10^7 pfu、7天后空斑实验 阅读提示：Methods中In vivo immunization小节及Figure 8图注 |
| HSV-1阴道感染模型 | HSV-1剂量10^4 PFU、感染体积10 μl、48小时后阴道冲洗液空斑实验 阅读提示：Methods中Viruses, viral transduction小节及Figure 8c图注 |