GEF-H1缺失小鼠的构建与验证
建立Arhgef2基因敲除小鼠模型并验证GEF-H1表达缺失。
使用基因陷阱ES细胞克隆IST13976A8注射C57BL/6囊胚，获得Arhgef2−/−小鼠；通过RT-PCR和免疫印迹验证GEF-H1 mRNA和蛋白表达缺失。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
GEF-H1 调控微管依赖的核酸感知以介导抗病毒宿主防御
GEF-H1 controls microtubule-dependent sensing of nucleic acids for antiviral host defenses.
实验完整度
高包含Arhgef2−/−小鼠模型、巨噬细胞体外实验、HEK293T细胞过表达、免疫共沉淀及多种病毒感染的体内外功能验证。
主要模型
Arhgef2−/−小鼠骨髓来源巨噬细胞 野生型小鼠骨髓来源巨噬细胞 HEK293T细胞过表达系统 Arhgef2−/−小鼠体内感染模型
重点核对
基因陷阱插入位于Arhgef2基因外显子4和5之间，使用C57BL/6 ES细胞克隆IST13976A8 5′ppp-dsRNA、HMW poly(I:C)、LMW poly(I:C)等配体转染浓度多为0.5 μg/ml，刺激时间16-24小时 EMCV感染MOI=0.1或1，甲型流感病毒感染MOI=0.1或1，体内滴鼻感染103 pfu 诺考达唑处理浓度未明确，佛司可林10 μM，冈田酸1 nM，处理40分钟 所有实验至少重复三次，统计采用双因素方差分析后Student t检验
摘要
深入理解细胞内病毒核酸感知并诱导I型干扰素产生的信号中间体，对于制定遏制病毒阻碍先天免疫防御的策略至关重要。本研究表明，由Arhgef2编码的微管相关鸟嘌呤核苷酸交换因子GEF-H1的激活，对于RIG-I样受体感知外源RNA是必需的。GEF-H1的激活调控巨噬细胞中RIG-I和Mda5依赖的IRF3磷酸化及干扰素-β表达的诱导。Arhgef2−/−小鼠的产生揭示了一个显著的信号缺陷，该缺陷阻止了对脑心肌炎病毒和甲型流感病毒的宿主抗病毒反应。微管网络隔离GEF-H1，激活后GEF-H1被释放，从而通过细胞内核酸检测通路实现抗病毒信号传导。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- GEF-H1在巨噬细胞感知细胞内病毒核酸并诱导I型干扰素的过程中是否发挥作用及其机制。
- 核心机制
- GEF-H1通过其DH结构域的核苷酸交换活性，在微管网络极化及S885去磷酸化释放后，与TBK1-IKKε相互作用，促进RIG-I/Mda5-MAVS通路中IRF3的磷酸化和核转位，从而诱导Ifnb1表达。
- 主要证据
- Arhgef2−/−巨噬细胞中RIG-I/Mda5配体诱导的Ifnb1 mRNA和IFN-β分泌显著降低，IRF3磷酸化和核转位受损，而NF-κB激活未受影响；HEK293T细胞中GEF-H1增强MAVS/TBK1诱导的Ifnb1启动子激活，且依赖DH结构域；微管解聚剂诺考达唑抑制RLR信号；Arhgef2−/−小鼠对EMCV和甲型流感病毒更易感。
- 研究意义
- GEF-H1是抗病毒信号的关键组分，指导MAVS依赖的核酸感知通路利用TBK1-IKKε，理解其激活和释放机制可能为抗病毒感染提供新的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
GEF-H1在RLR和TLR配体诱导IFN-β中的作用
确定GEF-H1是否特异性参与RIG-I/Mda5介导的IFN-β诱导。
用5′ppp-dsRNA、HMW poly(I:C)、LMW poly(I:C)、c-di-GMP及多种TLR配体刺激野生型和Arhgef2−/−巨噬细胞，检测Ifnb1 mRNA和IFN-β分泌。
GEF-H1对IRF3和NF-κB激活的影响
明确GEF-H1是否影响RLR下游IRF3和NF-κB的激活。
刺激野生型和Arhgef2−/−巨噬细胞，免疫印迹检测IRF3磷酸化、核转位及p65磷酸化和IκBα降解。
GEF-H1与MAVS/TBK1/IKKε的协同作用
解析GEF-H1在RLR信号通路中的作用位点。
在HEK293T细胞中共转染GEF-H1、MAVS、TBK1、IKKε及突变体，检测Ifnb1启动子或ISRE报告基因活性及IRF3磷酸化。
GEF-H1结构域及微管依赖性的机制研究
确定GEF-H1的DH结构域和微管结合对其功能的影响。
构建GEF-H1突变体（ΔDH、S885A、C53R），观察亚细胞定位，检测对MAVS/TBK1诱导Ifnb1启动子的影响；使用诺考达唑破坏微管，检测RLR信号。
GEF-H1在病毒感染中的功能验证
验证GEF-H1对ssRNA病毒感染的抗病毒防御作用。
用EMCV、NS1缺失甲型流感病毒、野生型甲型流感病毒感染巨噬细胞，检测IFN-β分泌、IRF3激活和病毒复制；用VSV感染检测病毒滴度。
GEF-H1在体内抗流感病毒防御中的作用
评估GEF-H1对小鼠体内甲型流感病毒感染的控制。
Arhgef2−/−小鼠和对照小鼠滴鼻接种LMW poly(I:C)或甲型流感病毒，检测支气管肺泡灌洗液IFN-β、肺泡巨噬细胞反应及肺组织病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素混合液 | -- | -- | |
| 巨噬细胞分化 | 巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- |
| 细胞刺激 | 5′三磷酸双链RNA | Invivogen | -- |
| 低分子量聚肌胞苷酸 | Invivogen | -- | |
| 高分子量聚肌胞苷酸 | Invivogen | -- | |
| 脂多糖 | Invivogen | -- | |
| 环二鸟苷酸 | Invivogen | -- | |
| Pam3CSK4 | Invivogen | -- | |
| 热灭活李斯特菌 | Invivogen | -- | |
| 鞭毛蛋白 | Invivogen | -- | |
| FSL-1 | Invivogen | -- | |
| 单链RNA | Invivogen | -- | |
| CpG寡脱氧核苷酸1826 | Invivogen | -- | |
| 微管解聚处理 | 诺考达唑 | Sigma | -- |
| 细胞处理 | 佛司可林 | Abcam | -- |
| 冈田酸 | Abcam | -- | |
| 细菌感染 | 庆大霉素溶液 | Sigma | -- |
| 质粒转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Amaxa小鼠巨噬细胞核转染试剂盒 | Lonza | -- | |
| 突变体构建 | Quikchange定点突变试剂盒 | Stratagene | -- |
| RNA提取 | Qiagen RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| 实时定量PCR | iQ SYBR Green Supermix试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| Bio-Rad CFX96实时PCR检测系统 | Bio-Rad | CFX96 | |
| 荧光素酶报告基因检测 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| IFN-β检测 | ELISA试剂盒（PBL interferon source） | PBL interferon source | -- |
| Luminex分析 | Affymetrix | -- | |
| 流式细胞术 | APC偶联抗CD11c抗体（HL3；550261） | BD Pharmingen | 550261 |
| PE偶联抗F4/80抗体（6F12；552958） | BD Pharmingen | 552958 | |
| PE偶联抗CD103抗体（M290；557495） | BD Pharmingen | 557495 | |
| APC-Cy7偶联抗CD4抗体（GK1.5；552051） | BD Pharmingen | 552051 | |
| PerCP偶联抗CD8抗体（53-6.7；553036） | BD Pharmingen | 553036 | |
| FITC偶联抗NK1.1抗体（PK136；553164） | BD Pharmingen | 553164 | |
| APC偶联抗CD19抗体（1D3；550992） | BD Pharmingen | 550992 | |
| 免疫印迹 | 辣根过氧化物酶标记抗FLAG抗体（M2；F1804） | Sigma | F1804 |
| 抗VSV抗体（P5D4；V5507） | Sigma | V5507 | |
| 抗S885磷酸化GEF-H1抗体（ab74156） | Abcam | ab74156 | |
| 抗IRF3抗体（D83B9；4302） | Cell Signaling Technology | 4302 | |
| 抗Ser396磷酸化IRF3抗体（4D4G；4947） | Cell Signaling Technology | 4947 | |
| 抗TBK1抗体（D1B4；3504） | Cell Signaling Technology | 3504 | |
| 抗MAVS抗体（3993） | Cell Signaling Technology | 3993 | |
| 抗STAT1抗体（9172） | Cell Signaling Technology | 9172 | |
| 抗Tyr701磷酸化STAT1抗体（58D6；9167） | Cell Signaling Technology | 9167 | |
| 抗IKKε抗体（D61F9；3416） | Cell Signaling Technology | 3416 | |
| 抗IκBα抗体（L35A5；4814） | Cell Signaling Technology | 4814 | |
| 抗S536磷酸化p65抗体（93H1；3033） | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗p65抗体（D14E12；8242） | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 抗β-actin抗体（8H10D10；3700） | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| 抗PCNA抗体（D3H8P；13110） | Cell Signaling Technology | 13110 | |
| 免疫荧光 | 抗α-微管蛋白抗体（ab4074） | Abcam | ab4074 |
| 免疫印迹 | 抗GEF-H1抗体（x1089p） | Exalpha Biologicals | -- |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488鬼笔环肽 | Invitrogen | -- |
| FITC偶联驴抗羊IgG（H+L）（713-095-147） | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 713-095-147 | |
| Cy3偶联驴抗兔IgG（H+L）（711-165-152） | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-165-152 | |
| 共聚焦显微镜 | Nikon A1R-A1共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| 流式细胞术 | FACSCalibur流式细胞仪 | BD Bioscience | -- |
| 质粒构建 | pCMV6-Entry-hGEF-H1质粒 | OriGene | -- |
| pCMV6-AC-GFP-hGEF-H1质粒 | OriGene | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GEF-H1缺失小鼠模型 | 基因陷阱ES细胞克隆IST13976A8；插入位点Arhgef2外显子4和5之间；小鼠背景C57BL/6；实验使用8-12周龄性别匹配同窝对照。 阅读提示：Online Methods“Generation of Arhgef2−/− mice”小节及Figure 1a,b。 |
| 巨噬细胞刺激实验 | 配体浓度：5′ppp-dsRNA 0.5 μg/ml，HMW/LMW poly(I:C) 0.5 μg/ml，c-di-GMP 10 μg/ml，LPS 0.2 μg/ml；刺激时间16-24小时；转染试剂Lipofectamine。 阅读提示：Figure 1c-g图注及Online Methods“Cells and reagents”小节。 |
| 病毒感染实验 | EMCV MOI=0.1或1；甲型流感病毒A/PR/8/34 ΔNS1 MOI=0.1或1；VSV MOI=0.1；感染时间4-48小时不等。 阅读提示：Figure 5、Figure 6图注及Online Methods“Viruses and viral infection”小节。 |
| 微管解聚与磷酸化调控实验 | 诺考达唑浓度文中未明确说明；佛司可林10 μM；冈田酸1 nM；处理时间40分钟。 阅读提示：Figure 3f,g及Figure 4c-e图注和Online Methods“Immunoprecipitation and immunoblotting”小节。 |
| 体内流感病毒感染 | 滴鼻接种体积20 μl（每鼻孔10 μl），剂量103 pfu；检测时间感染后4天；每组n=3。 阅读提示：Figure 6图注及Online Methods“Viruses and viral infection”小节。 |