药物敏感性筛选(DSRT)
评估HGSOC模型对45种药物的敏感性，确定药物浓度
使用3个HGSOC细胞系和5个PDC进行DSRT，计算DSS评分
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用于药物发现的多重单细胞RNA测序药物转录组学流程
A multiplex single-cell RNA-Seq pharmacotranscriptomics pipeline for drug discovery.
实验完整度
高包含细胞系、患者来源细胞、类器官等多模型，并有转录组、蛋白、功能及机制验证。
主要模型
HGSOC细胞系JHOS2、Kuramochi和Ovsaho 患者来源HGSOC原代细胞PDC1-PDC5 患者来源类器官PDO
重点核对
45种药物处理24小时，浓度基于DSRT筛选高于半数有效浓度，DMSO对照，双重复 96重scRNA-Seq使用20种抗B2M和抗CD298抗体-寡核苷酸偶联物进行Cell Hashing gedatolisib处理48小时，细胞系100 nM和500 nM，PDC 50 nM和100 nM gefitinib浓度：PDC 1 µM，细胞系10 µM；联合处理时gedatolisib等浓度依图注 DSRT使用384孔板，每孔1,000-1,500细胞，5个浓度梯度，3天，CellTiter-Glo检测
摘要
癌症药物应答的基因调控动力学尚未被完全理解。在此，我们报告一个能够通过使用抗体-寡核苷酸偶联物进行活细胞条形码标记来产生高通量药物转录组学分析的流程。该流程将药物筛选与96重单细胞RNA测序相结合。我们通过探索原发性高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）细胞在45种药物（涵盖13类不同作用机制）处理后的异质性转录景观，展示了该方法的潜力。一部分磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂诱导了受体酪氨酸激酶（如上皮生长因子受体EGFR）的激活，并且这是由小窝蛋白1（CAV1）的上调所介导的。对于表达CAV1和EGFR的HGSOC，这种耐药反馈环路可通过靶向PI3K-AKT-mTOR和EGFR的药物的协同作用来减轻。使用该工作流程可以实现对患者来源肿瘤样本在单细胞分辨率下的个性化检测。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在高通量单细胞水平解析癌症药物应答的转录异质性，并揭示耐药机制？
- 核心机制
- PI3K-AKT-mTOR抑制剂上调CAV1和EGFR，形成依赖CAV1和EGFR表达的耐药反馈环路；联合EGFR抑制剂可增强细胞毒性。
- 主要证据
- 对HGSOC细胞系和PDC进行45种药物处理后的96重scRNA-Seq分析，鉴定CAV1和EGFR上调；免疫印迹和免疫荧光验证蛋白水平；CAV1过表达和敲低实验证实功能依赖；联合gedatolisib和gefitinib在细胞系、PDC和PDO中增强细胞毒性。
- 研究意义
- 该流程可实现患者来源肿瘤样本的单细胞分辨率个性化检测，并提示PI3K-AKT-mTOR抑制剂与EGFR抑制剂联合治疗CAV1和EGFR表达HGSOC的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
96重单细胞RNA测序
解析药物处理后的单细胞转录组景观
对JHOS2、PDC2和PDC3进行45种药物处理24小时后，用抗体-寡核苷酸偶联物进行Cell Hashing，然后进行10x Genomics scRNA-Seq
转录组数据分析
鉴定药物作用机制相关的转录变化和差异表达基因
对scRNA-Seq数据进行解复用、聚类、差异表达分析和通路富集分析
CAV1和EGFR蛋白验证
验证PI3K-AKT-mTOR抑制剂对CAV1和EGFR蛋白水平的调控
免疫印迹和免疫荧光检测gedatolisib处理后的CAV1和EGFR蛋白水平
CAV1和EGFR功能验证
验证CAV1和EGFR在耐药反馈环路中的功能作用
过表达CAV1-Flag或siRNA敲低CAV1/EGFR，结合gedatolisib处理，检测EGFR和CAV1蛋白水平及细胞活力
联合用药效果评估
评估PI3K-AKT-mTOR抑制剂与EGFR抑制剂联合的细胞毒性
在细胞系、PDC和PDO中测试gedatolisib和gefitinib单用或联合的细胞活力
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 21331020 |
| 胎牛血清 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11573397 | |
| 超谷氨酰胺 | Lonza | BE17-605E/U1 | |
| MEM非必需氨基酸溶液 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Primocin抗生素 | Invivogen | ant-pm-2 | |
| RPMI-1640培养基 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 31870025 | |
| B27添加剂 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| 表皮生长因子 | Corning | 354052 | |
| 成纤维细胞生长因子 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PHG0023 | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| 霍乱毒素 | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| 腺嘌呤 | Sigma-Aldrich | A2786 | |
| Y-27632 | Enzo Life Science | ALX-270-333 | |
| Primaria培养板 | Corning | 353846 | |
| TrypLE Express酶 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 12605010 | |
| Cell Hashing | 抗B2M抗体-寡核苷酸偶联物 | BioLegend | 316302 |
| 抗CD298抗体-寡核苷酸偶联物 | BioLegend | 341712 | |
| scRNA-Seq | Chromium Next GEM单细胞3′基因表达v3.1双索引化学试剂盒 | 10x Genomics | CG000317 |
| 免疫印迹 | gedatolisib | Selleck Chemicals | s2628 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Bimake (now Selleck Chemicals) | B15001 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Bimake (now Selleck Chemicals) | B14001 | |
| 免疫沉淀 | EGFR抗体 | Cell Signaling Technology (CST) | 4267 |
| Ultra-LEAF纯化重组人IgG1同型对照 | BioLegend | 403501 | |
| 蛋白A琼脂糖珠 | CST | 9863 | |
| 免疫印迹 | 2× Laemmli上样缓冲液 | Bio-Rad Laboratories | 1610737 |
| 抗β-微管蛋白抗体 | CST | 86298 | |
| 抗AKT抗体 | CST | 2920 | |
| 抗磷酸化AKT (S473)抗体 | CST | 4060 | |
| 抗CAV1抗体 | CST | 3267 | |
| 抗EGFR抗体 | CST | 4267 | |
| 抗ERK1–ERK2抗体 | CST | 4696 | |
| 抗磷酸化ERK1–ERK2抗体 | CST | 9101 | |
| IRDye 800CW驴抗小鼠IgG | LI-COR | 926-32212 | |
| IRDye 680RD驴抗兔IgG | LI-COR | 926-68073 | |
| AzureSpectra荧光二抗山羊抗小鼠550 | Azure Biosystems | AC2159 | |
| 免疫荧光 | afuresertib | FIMM | FIMM136448 |
| AZD-8186 | Active Biochem | A-1610 | |
| idelalisib | FIMM | FIMM003750 | |
| pictilisib | MedChemExpress | HY-50094 | |
| sapanisertib | FIMM | FIMM109442 | |
| 牛血清白蛋白 | BioWest | P6154 | |
| AlexaFluor Plus 594驴抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | A32754 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Immu-Mount封片剂 | Fisher Scientific | 9990402 | |
| DSRT | CellTiter-Glo 2.0检测试剂盒 | Promega | G9242 |
| 类器官培养 | VitroGel ORGANOID-4 | TheWell Bioscience | VHM04-4 |
| 类器官活力检测 | TMRE | Abcam | -- |
| siRNA沉默 | CAV1 siRNA | Dharmacon Reagents | L-003467-00-0005 |
| EGFR siRNA | Dharmacon Reagents | L-003114-00-0005 | |
| 对照siRNA | Dharmacon Reagents | D-001810-10-05 | |
| DharmaFECT 1转染试剂 | Dharmacon Reagents | T-2001-02 | |
| 质粒转染 | FuGENE HD转染试剂 | Promega | E2311 |
| pSG5质粒 | Agilent Technologies | 216201 | |
| 克隆形成实验 | 结晶紫 | Sigma-Aldrich | C3886 |
| 甲醇 | Fisher Chemical | 10653963 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 药物处理与scRNA-Seq | 药物浓度：基于DSRT筛选高于半数有效浓度，具体见Supplementary Table 1；处理时间24小时；DMSO对照；双重复 阅读提示：Methods 'Cell Hashing and scRNA-Seq' 及 Supplementary Table 1 |
| Cell Hashing | 抗体-寡核苷酸偶联物克隆号：B2M (316302, BioLegend)和CD298 (341712, BioLegend)；20种HTO组合 阅读提示：Methods 'Cell Hashing and scRNA-Seq' 及 Supplementary Table 3 |
| 免疫印迹药物处理 | gedatolisib浓度：细胞系100 nM和500 nM，PDC 50 nM和100 nM；处理48小时；PBS对照 阅读提示：Methods 'Immunoblotting and immunoprecipitation' 及图5b |
| 联合用药细胞活力检测 | gefitinib浓度：PDC 1 µM，细胞系10 µM；gedatolisib等浓度依图注；处理72小时；5个技术重复 阅读提示：Methods 'DSRT and small-scale drug combination testing' 及图6c |
| 类器官药物处理 | gedatolisib 50 nM和gefitinib 500 nM；处理12天；TMRE染色；3个重复 阅读提示：Methods 'Image-based small-scale drug testing of PDOs' 及图6e |