光亲和探针标记与富集
在细胞内标记小分子-蛋白质相互作用并富集探针修饰肽段
HEK293T细胞与FFF探针孵育后UV交联，裂解，点击化学连接生物素标签，链霉亲和素富集，胰蛋白酶消化，释放标记肽段。
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细胞内小分子结合位点的增强映射
Enhanced mapping of small-molecule binding sites in cells.
实验完整度
高基于HEK293T细胞化学蛋白质组学、TMT定量、免疫印迹、CETSA及分子对接等多层级功能与机制验证
主要模型
HEK293T细胞 光亲和探针（FFF探针及对映体探针） AlphaFold/PDB蛋白质结构
重点核对
HEK293T细胞在无血清培养基中与探针孵育30分钟，浓度如各图所示 365 nm UV照射20分钟，4°C，诱导交联 点击化学使用TBTA、CuSO4、生物素-叠氮标签和TCEP，室温1小时 链霉亲和素富集后胰蛋白酶消化，SoL肽段用2%甲酸释放 TMT标记后合并，高pH反相分级为6个组分进行LC-MS/MS
摘要
光亲和探针通常用于识别与小分子相互作用的蛋白质。然而，尽管这种用途很常见，但解析这些相互作用的具体位点仍然是一个挑战。在这里，我们开发了一种化学蛋白质组学工作流程，用于确定细胞内光亲和探针的精确蛋白质结合位点。对探针修饰肽段独特特征（例如它们产生嵌合光谱的倾向）的解卷积，促进了预测模型的开发，以自信地确定标记位点。这产生了内源性蛋白质上小分子结合位点的广泛图谱，并使得能够与多重定量相结合，提高实验的通量和维度。最后，利用结构信息，我们表征了蛋白质组中不同的结合位点，提供了它们对小分子可处理性的直接证据。总之，我们的发现揭示了对光亲和探针分析的新知识，并提供了一种在天然系统中大规模高分辨率映射可逆小分子相互作用的稳健方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何精确确定光亲和探针在细胞内与内源性蛋白质的结合位点，并提高位点鉴定的覆盖度和置信度？
- 核心机制
- 光亲和探针标记的肽段在MS2中产生嵌合光谱，利用delta score、PSM数量、保留时间等特征构建预测模型，可自动化、客观地鉴定探针标记位点。
- 主要证据
- 在HEK293T细胞中使用FFF探针进行化学蛋白质组学，结合同位素标记富集标签和TMT定量，鉴定3603个独特标记肽段（1669个蛋白质），并通过免疫印迹、CETSA和竞争实验验证多个相互作用。
- 研究意义
- 提供了在天然系统中大规模高分辨率映射可逆小分子相互作用的方法，并揭示了蛋白质组中多种可配体结合口袋，有助于配体设计和化学生物学探针开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
质谱数据采集与嵌合光谱分析
鉴定探针标记肽段并解析嵌合光谱特征
LC-MS/MS分析，比较标记与未标记肽段的光谱特征，允许多个PSM匹配同一光谱（multiPSM搜索）。
预测模型构建与Dizco流程开发
构建预测探针标记肽段的概率模型并自动化鉴定标记位点
使用delta score、PSM数量、保留时间等特征训练逻辑回归模型，开发Dizco工作流整合multiPSM和模型评分。
TMT多重定量与浓度依赖分析
实现多重定量并构建位点特异性的浓度依赖曲线
将Dizco与TMT定量结合，分析探针3、8及对映体探针在7个浓度下的结合。
正交验证探针-蛋白质相互作用
验证质谱鉴定的结合事件及立体选择性
进行探针pull-down免疫印迹、竞争实验和CETSA。
结构映射与分子对接
将标记位点映射到蛋白质结构，预测结合口袋和结合模式
使用PDB和AlphaFold结构，Fpocket预测口袋，AutoDock-GPU进行盲对接。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 化学蛋白质组学样品制备 | 生物素-PEG3-叠氮 | Click Chemistry Tools | AZ104 |
| 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | V5111 | |
| Pierce链霉亲和素琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
| TMT10plex同量异序标记试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 90406 | |
| TMTpro 16plex标记试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A44520 | |
| Halt蛋白酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | 78438 | |
| Pierce高pH反相分级试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 84868 | |
| 免疫印迹 | 抗GSTM3多克隆抗体 | Proteintech | 15214-1-AP |
| 抗PMPCA多克隆抗体 | Proteintech | 26536-1-AP | |
| 抗PARP1单克隆抗体 | Proteintech | 66520-1-Ig | |
| 抗GDI2多克隆抗体 | Proteintech | 10116-1-AP | |
| 抗ACAT2单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 13294 | |
| 抗ACAD9多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9796 | |
| 抗BAX多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2772 | |
| 抗PBEF/NAMPT单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 86634 | |
| 抗MTHFD2多克隆抗体 | Abcam | ab151447 | |
| 抗ABHD12单克隆抗体 | Abcam | ab182011 | |
| 抗小鼠-HRP山羊多克隆抗体 | Abcam | ab6789 | |
| 抗兔-HRP山羊多克隆抗体 | Abcam | ab6721 | |
| 抗CDK1单克隆抗体 | Invitrogen | 33–1800 | |
| 抗PCYOX1L多克隆抗体 | Invitrogen | PA5-57955 | |
| 抗mEH多克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-135984 | |
| 罗丹明标记肌动蛋白hFAB | Bio-Rad | 12004164 | |
| 药物处理 | 奥拉帕利 | MedChemExpress | HY-10162 |
| DO264 | Cayman Chemical | 29402 | |
| LY345899 | Cayman Chemical | 36627 | |
| 辅酶A | Cayman Chemical | 16147 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与探针处理 | HEK293T细胞培养条件：37°C, 5% CO2, DMEM + 10% FBS + 1%青霉素/链霉素 + 2 mM谷氨酰胺；探针处理：无血清培养基，30分钟，浓度如各图所示 阅读提示：Methods: Cell Culture; Chemoproteomic Sample Preparation |
| UV交联 | 365 nm UV照射20分钟，4°C 阅读提示：Methods: Chemoproteomic Sample Preparation |
| 点击化学与富集 | 点击化学试剂浓度：TBTA 1.7 mM, CuSO4 50 mM, 生物素-叠氮10 mM, TCEP 50 mM；室温1小时；链霉亲和素富集1.5小时 阅读提示：Methods: Chemoproteomic Sample Preparation |
| LC-MS/MS分析 | 质谱参数：Orbitrap Fusion Lumos，HCD 28%，MS1分辨率60,000（非定量SoL）或120,000（TMT全蛋白），MS2分辨率15,000 阅读提示：Methods: LC-MS Analysis |
| TMT定量实验 | TMT标记按照制造商说明，高pH反相分级为6个组分；浓度依赖实验使用7个浓度：10, 20, 40, 80, 100, 150, 200 μM 阅读提示：Methods: Chemoproteomic Sample Preparation; Figure 5 legend |
| CETSA | 细胞与探针孵育30分钟，37°C；温度梯度加热3分钟，25°C 3分钟；液氮冻融3次；100,000 × g离心20分钟 阅读提示：Methods: Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) |