感觉神经支配软腭的时空分布分析
明确三叉神经感觉神经纤维在腭发育过程中的空间分布及其与软腭肌肉的地理关系。
利用 AvCreERT2;tdTomato 和 Pax7-CreER;ZsGreen 小鼠,结合全组织透明化、TUJ1/TH/VAChT 免疫染色和 RNAscope,观察 E13.5–E18.5 腭部神经纤维分布。
Sensory nerve-derived signaling coordinates oropharyngeal structural organization that supports suckling and vocalization in neonatal mice.
包含体外细胞实验、条件敲除小鼠模型、空间转录组和单细胞测序、药理学 rescue 及多种生理功能检测。
AvCreERT2;Gdf11fl/fl 感觉神经元特异性 Gdf11 敲除小鼠 Osr2-Cre;Gdf11fl/fl 腭间充质特异性 Gdf11 敲除小鼠 E14.0 小鼠软腭间充质原代细胞 Pax7-CreER;Ai6 小鼠软腭来源原代成肌细胞
感觉神经元特异性 Gdf11 敲除效率:三叉神经节 Gdf11 转录水平和软腭 GDF11 蛋白沉积 软腭肌肉表型:LVP 肌肉体积、MHC 阳性面积、肌管数量和直径、双侧连续性 吸吮功能:PN3 和 PN6 人工奶嘴检测的口内压峰值频率、峰值幅度和总功率 发声功能:PN6 超声发声的音节数量、音节时长、音高范围和响度 AKT 激活 rescue:SC79 处理对 p-AKT 水平、LVP 肌肉形态及生理功能的恢复程度
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
明确三叉神经感觉神经纤维在腭发育过程中的空间分布及其与软腭肌肉的地理关系。
利用 AvCreERT2;tdTomato 和 Pax7-CreER;ZsGreen 小鼠,结合全组织透明化、TUJ1/TH/VAChT 免疫染色和 RNAscope,观察 E13.5–E18.5 腭部神经纤维分布。
筛选并验证来源于三叉神经感觉神经元、可能调控软腭肌肉发育的信号分子。
对 E13.5 小鼠三叉神经节和软腭进行 scRNA-seq 及细胞通讯分析;对 AvCreERT2;Rosa-DTA 小鼠三叉神经节进行 bulk RNA-seq;通过免疫染色验证 GDF11 在 Avil+ 感觉神经元中的表达和软腭中的沉积。
验证感觉神经元来源的 GDF11 对软腭肌肉形态和结构完整性的体内功能。
在 E10.5 诱导 AvCreERT2;Gdf11fl/fl 小鼠,通过 H&E、MHC 免疫染色、micro-CT 和全组织 TUJ1 染色评估 LVP 肌肉体积、肌纤维直径、肌管数量和双侧连续性,并检查舌和咬肌。
评估软腭肌肉缺陷是否导致吸吮、营养摄入和发声功能障碍。
使用人工奶嘴装置记录 PN3 和 PN6 幼鼠口内压;进行 6 小时禁食后 2 小时哺乳的摄食效率测试;在 PN6 记录超声发声并用 VocalMat 分析音节特征。
确定 GDF11 缺失影响软腭肌肉发育的细胞靶点和信号通路。
通过 EdU 增殖检测、TUNEL 凋亡检测、多阶段 scRNA-seq 标志物分析、seqFISH 空间转录组和 bulk RNA-seq,分析 E14.0 软腭间充质细胞组成和信号通路变化;用 Western blot 和 p-AKT 免疫染色验证 PI3K-Akt-FoxO1 通路。
验证肌周细胞来源的 THBS3 是否通过 ITGA9 抑制软腭成肌分化。
利用 CellChat 分析肌周细胞-成肌细胞通讯,鉴定 THBS3-SDC1/CD47 配体受体对;通过 RNAscope 和 bulk RNA-seq 验证 Thbs3 表达;在体外共培养体系中使用 siRNA 敲低 Thbs3 或 Itga9,检测 MHC+ 肌管形成。
测试 AKT 激活是否能部分恢复软腭肌肉组织和口咽功能。
在 E13.0 和 E14.0 给予孕鼠 SC79 或 vehicle,E14.5 检测 p-AKT,E15.5 检测 Myl1 表达,E18.5 检测 LVP 肌肉形态;在 PN3 和 PN6 评估吸吮、摄食效率和超声发声。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 他莫昔芬诱导 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| 玉米油 | Sigma-Aldrich | C8267 | |
| EdU增殖检测 | 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 | Thermo Fisher Scientific | A10044 |
| EdU细胞增殖试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10637 | |
| AKT激活处理 | SC79 | Sigma-Aldrich | 123871 |
| 组织透明化 | Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 尿素 | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| 全组织免疫染色 | 抗βIII微管蛋白抗体 | Abcam | ab18207 |
| 抗酪氨酸羟化酶抗体 | Sigma-Aldrich | AB152 | |
| 抗囊泡乙酰胆碱转运体抗体 | Synaptic System | 139-103 | |
| 组织固定 | 福尔马林 | MilliporeSigma | HT501128 |
| 组织包埋 | OCT包埋剂 | Sakura | 4583 |
| 免疫染色 | 柠檬酸盐基抗原修复液 | Vector Laboratories | H-3300 |
| Triton X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| 过氧化氢封闭试剂 | Abcam | ab64218 | |
| 1%封闭液 | PerkinElmer | FP1012 | |
| TSA多重免疫荧光 | TSA Plus FITC | Akoya Bioscience | NEL774001KT |
| TSA Plus Cy3 | Akoya Bioscience | NEL771B001KT | |
| 免疫染色 | DAPI | Invitrogen | 62248 |
| Fluoro-Gel封片剂 | EMS | 17985-10 | |
| 抗MyoD抗体 | Abcam | ab13627 | |
| 抗RFP抗体 | Rockland | 600-401-379 | |
| 抗肌球蛋白重链抗体 | DSHB | MF20 | |
| 抗GDF11抗体 | Novus Biologicals | NBP2-57399 | |
| 抗磷酸化Akt (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗兔HRP抗体 | Vector Laboratories | PI-1000 | |
| Alexa Fluor 488抗小鼠抗体 | Thermo Fisher Scientific | A110001 | |
| Alexa Fluor 488抗兔抗体 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Alexa Fluor 555抗兔抗体 | Thermo Fisher Scientific | A31572 | |
| Alexa Fluor 647抗兔抗体 | Thermo Fisher Scientific | A32795 | |
| RNAscope原位杂交 | RNAscope多重荧光v2试剂盒 | Advanced Cell Diagnostics | 323100 |
| 小鼠Hic1探针 | Advanced Cell Diagnostics | 464131 | |
| 小鼠Tbx15探针 | Advanced Cell Diagnostics | 558761 | |
| 小鼠Aldh1a2探针 | Advanced Cell Diagnostics | 447391 | |
| 小鼠Myog探针 | Advanced Cell Diagnostics | 492921 | |
| 小鼠Myl1探针 | Advanced Cell Diagnostics | 548421-C2 | |
| 小鼠Gdf11探针 | Advanced Cell Diagnostics | 425221-C3 | |
| 小鼠Myod1探针 | Advanced Cell Diagnostics | 316081 | |
| 小鼠Itga9探针 | Advanced Cell Diagnostics | 540721 | |
| 小鼠Itgb1探针 | Advanced Cell Diagnostics | 514281 | |
| 小鼠Sdc1探针 | Advanced Cell Diagnostics | 813921-C2 | |
| 小鼠Foxo1探针 | Advanced Cell Diagnostics | 485761 | |
| 小鼠Thbs3探针 | Advanced Cell Diagnostics | 883671-C2 | |
| TUNEL实验 | TUNEL实验试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10617 |
| scRNA-seq组织解离 | I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C9791 |
| 中性蛋白酶 | Sigma-Aldrich | D4818 | |
| scRNA-seq文库构建 | 单细胞3' v2试剂盒 | 10x Genomics | PN-120267 |
| bulk RNA-seq | RNeasy微量RNA提取试剂盒 | Qiagen | 74004 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Cell Signaling Technology | 9806 |
| PVDF膜 | Millipore | ISEQ00005 | |
| 抗磷酸化PI3K抗体 | Cell Signaling Technology | 4228 | |
| 抗PI3K抗体 | Cell Signaling Technology | 4257 | |
| 抗Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| 抗FoxO1抗体 | Cell Signaling Technology | 2880 | |
| 抗FoxO3a抗体 | Cell Signaling Technology | 2497 | |
| 抗磷酸化SMAD2抗体 | Cell Signaling Technology | 18338 | |
| 抗SMAD2/3抗体 | Cell Signaling Technology | 5339 | |
| 抗磷酸化p38抗体 | Cell Signaling Technology | 4511 | |
| 抗p38抗体 | Cell Signaling Technology | 8690 | |
| 抗磷酸化Erk1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗Erk1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| 原代间充质细胞培养 | α-MEM培养基 | GIBCO | 12571063 |
| 青霉素-链霉素 | GIBCO | 2019321 | |
| FOXO1抑制处理 | AS1842856 | Sigma | 344355 |
| EdU增殖检测 | Click-iT Plus EdU细胞增殖试剂盒 | Thermo Fisher | C10637 |
| siRNA转染 | Thbs3 Silencer Select预设计siRNA | Thermo Fisher Scientific | s75101 |
| Itga9 Silencer Select预设计siRNA | Thermo Fisher Scientific | s233797 | |
| Silencer Select阴性对照siRNA | Thermo Fisher Scientific | 4390843 | |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| ChIP-qPCR | SimpleChIP Plus酶法染色质IP试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9005 |
| SsoFast EvaGreen预混液 | Bio-Rad | 172-5202 | |
| 人工奶嘴实验 | 硅胶奶嘴 | Smooth On, Inc. | -- |
| 压力传感器 | SMI | 5652-001 | |
| 数据采集设备 | NI | USB-6009 | |
| 超声发声记录 | 超声记录系统 | Avisoft Bioacoustics Inc. | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 感觉神经元特异性 Gdf11 敲除 | 他莫昔芬诱导时间(E10.5)、剂量(1.5 mg/10 g 体重)和给药方式(腹腔注射);Gdf11fl/fl 品系背景 阅读提示:Methods 中 Tamoxifen, EdU and SC79 administration 小节及 Mice 小节 |
| 人工奶嘴吸吮功能检测 | 检测日龄(PN3 和 PN6)、每次记录时长(60 秒)、每只幼鼠测试次数(5 次)、奶嘴涂层(玉米油)及基因型盲法 阅读提示:Methods 中 Artificial nipple assay 小节 |
| 摄食效率检测 | 禁食时长(6 小时)、哺乳时长(2 小时)、称重时间点、加热垫温度(37°C)及基因型盲法 阅读提示:Methods 中 Feeding efficiency assay 小节 |
| 超声发声检测 | 检测日龄(PN6)、记录时长(5 分钟)、隔音室条件、基因型盲法及分析软件(Avisoft SASLab Pro、VocalMat) 阅读提示:Methods 中 Ultrasonic vocalization assay 小节 |
| SC79 药理 rescue | SC79 剂量(10 mg/kg)、给药时间(E13.0 和 E14.0)、给药方式(腹腔注射)、vehicle 配方及 E19.0 剖宫产 阅读提示:Methods 中 Tamoxifen, EdU and SC79 administration 小节 |
| 空间转录组(seqFISH) | 胚胎日龄(E14.0)、自定义基因 panel 设计依据、聚类分析方法及对照与突变组比较设计 阅读提示:Methods 中 Spatial transcriptomic analysis (SeqFISH) 小节 |