感觉神经来源的信号协调新生儿小鼠口咽部结构组织,支持吸吮和发声

Sensory nerve-derived signaling coordinates oropharyngeal structural organization that supports suckling and vocalization in neonatal mice.

作者信息Sa Cha, Jifan Feng, Tingwei Guo, Lin Meng, Peng Chen, Calista Ly, Thach-Vu Ho, Pedro A Sanchez-Lara, Lauren E McElvain, Jeffrey D Moore, Yang Chai
PMID42449098
发布时间2026-07-14
DOI10.1038/s41467-026-74959-0

实验完整度

高

包含体外细胞实验、条件敲除小鼠模型、空间转录组和单细胞测序、药理学 rescue 及多种生理功能检测。

主要模型

AvCreERT2;Gdf11fl/fl 感觉神经元特异性 Gdf11 敲除小鼠 Osr2-Cre;Gdf11fl/fl 腭间充质特异性 Gdf11 敲除小鼠 E14.0 小鼠软腭间充质原代细胞 Pax7-CreER;Ai6 小鼠软腭来源原代成肌细胞

重点核对

感觉神经元特异性 Gdf11 敲除效率:三叉神经节 Gdf11 转录水平和软腭 GDF11 蛋白沉积 软腭肌肉表型:LVP 肌肉体积、MHC 阳性面积、肌管数量和直径、双侧连续性 吸吮功能:PN3 和 PN6 人工奶嘴检测的口内压峰值频率、峰值幅度和总功率 发声功能:PN6 超声发声的音节数量、音节时长、音高范围和响度 AKT 激活 rescue:SC79 处理对 p-AKT 水平、LVP 肌肉形态及生理功能的恢复程度

摘要

适当的口咽功能对于吸吮、进食和言语至关重要,并依赖于腭部、口咽部肌肉以及控制它们的颅神经的协调发育。这种整合的破坏会导致严重的新生儿并发症。然而,神经肌肉结构如何在发育过程中协调以支持口咽功能仍不清楚。利用单细胞和空间转录组学,我们鉴定出三叉神经来源的GDF11是通过颅神经嵴来源的肌周细胞(perimysial cells)发挥作用的关键软腭肌肉结构调节因子,并由Akt-FoxO1-Thbs3信号介导,以建立肌肉结构完整性和双侧连续性。为了评估其在体内的功能相关性,我们采用了一系列生理学检测来评估新生小鼠的口咽功能,并发现感觉神经元特异性Gdf11缺失重现了在携带GDF11突变的个体中观察到的软腭畸形和相关的口咽功能障碍,包括吸吮受损、口咽运动效能降低和发声异常。AKT的药理学激活部分恢复了Gdf11突变小鼠的软腭肌肉组织并改善了相关的生理缺陷。总之,这些发现表明感觉神经来源的营养信号对于协调的口咽形态发生和功能是不可或缺的,并为针对先天性口咽疾病中神经肌肉整合的治疗方法建立了临床前框架。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
感觉神经来源的信号如何协调口咽部神经肌肉结构的发育,以支持吸吮和发声等口咽功能?
核心机制
三叉神经感觉神经元来源的 GDF11 通过颅神经嵴来源的肌周细胞,经 Akt-FoxO1-Thbs3 信号轴调控软腭肌肉结构完整性和双侧连续性。
主要证据
单细胞和空间转录组学鉴定 GDF11 及肌周细胞;AvCreERT2;Gdf11fl/fl 小鼠重现软腭肌肉畸形及吸吮、发声和营养摄入缺陷;SC79 药理激活 AKT 部分恢复肌肉组织和生理功能。
研究意义
为先天性口咽疾病中神经肌肉整合的治疗策略提供了临床前框架,并建立了评估小鼠口咽功能的行为学检测组合。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

感觉神经支配软腭的时空分布分析

明确三叉神经感觉神经纤维在腭发育过程中的空间分布及其与软腭肌肉的地理关系。

利用 AvCreERT2;tdTomato 和 Pax7-CreER;ZsGreen 小鼠,结合全组织透明化、TUJ1/TH/VAChT 免疫染色和 RNAscope,观察 E13.5–E18.5 腭部神经纤维分布。

2

鉴定三叉神经来源的 GDF11 作为候选调控因子

筛选并验证来源于三叉神经感觉神经元、可能调控软腭肌肉发育的信号分子。

对 E13.5 小鼠三叉神经节和软腭进行 scRNA-seq 及细胞通讯分析;对 AvCreERT2;Rosa-DTA 小鼠三叉神经节进行 bulk RNA-seq;通过免疫染色验证 GDF11 在 Avil+ 感觉神经元中的表达和软腭中的沉积。

3

感觉神经元特异性 Gdf11 敲除小鼠的软腭肌肉表型分析

验证感觉神经元来源的 GDF11 对软腭肌肉形态和结构完整性的体内功能。

在 E10.5 诱导 AvCreERT2;Gdf11fl/fl 小鼠,通过 H&E、MHC 免疫染色、micro-CT 和全组织 TUJ1 染色评估 LVP 肌肉体积、肌纤维直径、肌管数量和双侧连续性,并检查舌和咬肌。

4

Gdf11 敲除小鼠口咽功能的生理学评估

评估软腭肌肉缺陷是否导致吸吮、营养摄入和发声功能障碍。

使用人工奶嘴装置记录 PN3 和 PN6 幼鼠口内压;进行 6 小时禁食后 2 小时哺乳的摄食效率测试;在 PN6 记录超声发声并用 VocalMat 分析音节特征。

5

肌周细胞介导 GDF11 调控软腭成肌的细胞学机制

确定 GDF11 缺失影响软腭肌肉发育的细胞靶点和信号通路。

通过 EdU 增殖检测、TUNEL 凋亡检测、多阶段 scRNA-seq 标志物分析、seqFISH 空间转录组和 bulk RNA-seq,分析 E14.0 软腭间充质细胞组成和信号通路变化;用 Western blot 和 p-AKT 免疫染色验证 PI3K-Akt-FoxO1 通路。

6

THBS3-ITGA9 介导肌周细胞对成肌细胞的抑制性调控

验证肌周细胞来源的 THBS3 是否通过 ITGA9 抑制软腭成肌分化。

利用 CellChat 分析肌周细胞-成肌细胞通讯,鉴定 THBS3-SDC1/CD47 配体受体对;通过 RNAscope 和 bulk RNA-seq 验证 Thbs3 表达;在体外共培养体系中使用 siRNA 敲低 Thbs3 或 Itga9,检测 MHC+ 肌管形成。

7

SC79 药理激活 AKT 对 Gdf11 突变小鼠的 rescue 效果

测试 AKT 激活是否能部分恢复软腭肌肉组织和口咽功能。

在 E13.0 和 E14.0 给予孕鼠 SC79 或 vehicle,E14.5 检测 p-AKT,E15.5 检测 Myl1 表达,E18.5 检测 LVP 肌肉形态;在 PN3 和 PN6 评估吸吮、摄食效率和超声发声。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
他莫昔芬Sigma-AldrichT5648
玉米油Sigma-AldrichC8267
5-乙炔基-2'-脱氧尿苷Thermo Fisher ScientificA10044
EdU细胞增殖试剂盒Thermo Fisher ScientificC10637
SC79Sigma-Aldrich123871
QuadrolSigma-Aldrich122262
蔗糖Sigma-AldrichS9378
尿素Sigma-AldrichU5378
抗βIII微管蛋白抗体Abcamab18207
抗酪氨酸羟化酶抗体Sigma-AldrichAB152
抗囊泡乙酰胆碱转运体抗体Synaptic System139-103
福尔马林MilliporeSigmaHT501128
OCT包埋剂Sakura4583
柠檬酸盐基抗原修复液Vector LaboratoriesH-3300
Triton XSigma AldrichT8787
过氧化氢封闭试剂Abcamab64218
1%封闭液PerkinElmerFP1012
TSA Plus FITCAkoya BioscienceNEL774001KT
TSA Plus Cy3Akoya BioscienceNEL771B001KT
DAPIInvitrogen62248
Fluoro-Gel封片剂EMS17985-10
抗MyoD抗体Abcamab13627
抗RFP抗体Rockland600-401-379
抗肌球蛋白重链抗体DSHBMF20
抗GDF11抗体Novus BiologicalsNBP2-57399
抗磷酸化Akt (Ser473)抗体Cell Signaling Technology4060
抗兔HRP抗体Vector LaboratoriesPI-1000
Alexa Fluor 488抗小鼠抗体Thermo Fisher ScientificA110001
Alexa Fluor 488抗兔抗体Thermo Fisher ScientificA11008
Alexa Fluor 555抗兔抗体Thermo Fisher ScientificA31572
Alexa Fluor 647抗兔抗体Thermo Fisher ScientificA32795
RNAscope多重荧光v2试剂盒Advanced Cell Diagnostics323100
小鼠Hic1探针Advanced Cell Diagnostics464131
小鼠Tbx15探针Advanced Cell Diagnostics558761
小鼠Aldh1a2探针Advanced Cell Diagnostics447391
小鼠Myog探针Advanced Cell Diagnostics492921
小鼠Myl1探针Advanced Cell Diagnostics548421-C2
小鼠Gdf11探针Advanced Cell Diagnostics425221-C3
小鼠Myod1探针Advanced Cell Diagnostics316081
小鼠Itga9探针Advanced Cell Diagnostics540721
小鼠Itgb1探针Advanced Cell Diagnostics514281
小鼠Sdc1探针Advanced Cell Diagnostics813921-C2
小鼠Foxo1探针Advanced Cell Diagnostics485761
小鼠Thbs3探针Advanced Cell Diagnostics883671-C2
TUNEL实验试剂盒Thermo Fisher ScientificC10617
I型胶原酶Sigma-AldrichC9791
中性蛋白酶Sigma-AldrichD4818
单细胞3' v2试剂盒10x GenomicsPN-120267
RNeasy微量RNA提取试剂盒Qiagen74004
RIPA裂解液Cell Signaling Technology9806
PVDF膜MilliporeISEQ00005
抗磷酸化PI3K抗体Cell Signaling Technology4228
抗PI3K抗体Cell Signaling Technology4257
抗Akt抗体Cell Signaling Technology4691
抗FoxO1抗体Cell Signaling Technology2880
抗FoxO3a抗体Cell Signaling Technology2497
抗磷酸化SMAD2抗体Cell Signaling Technology18338
抗SMAD2/3抗体Cell Signaling Technology5339
抗磷酸化p38抗体Cell Signaling Technology4511
抗p38抗体Cell Signaling Technology8690
抗磷酸化Erk1/2抗体Cell Signaling Technology4370
抗Erk1/2抗体Cell Signaling Technology9102
α-MEM培养基GIBCO12571063
青霉素-链霉素GIBCO2019321
AS1842856Sigma344355
Click-iT Plus EdU细胞增殖试剂盒Thermo FisherC10637
Thbs3 Silencer Select预设计siRNAThermo Fisher Scientifics75101
Itga9 Silencer Select预设计siRNAThermo Fisher Scientifics233797
Silencer Select阴性对照siRNAThermo Fisher Scientific4390843
Lipofectamine RNAiMAX转染试剂Thermo Fisher Scientific13778-075
SimpleChIP Plus酶法染色质IP试剂盒Cell Signaling Technology9005
SsoFast EvaGreen预混液Bio-Rad172-5202
硅胶奶嘴Smooth On, Inc.--
压力传感器SMI5652-001
数据采集设备NIUSB-6009
超声记录系统Avisoft Bioacoustics Inc.--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
感觉神经元特异性 Gdf11 敲除
他莫昔芬诱导时间(E10.5)、剂量(1.5 mg/10 g 体重)和给药方式(腹腔注射);Gdf11fl/fl 品系背景
阅读提示:Methods 中 Tamoxifen, EdU and SC79 administration 小节及 Mice 小节
人工奶嘴吸吮功能检测
检测日龄(PN3 和 PN6)、每次记录时长(60 秒)、每只幼鼠测试次数(5 次)、奶嘴涂层(玉米油)及基因型盲法
阅读提示:Methods 中 Artificial nipple assay 小节
摄食效率检测
禁食时长(6 小时)、哺乳时长(2 小时)、称重时间点、加热垫温度(37°C)及基因型盲法
阅读提示:Methods 中 Feeding efficiency assay 小节
超声发声检测
检测日龄(PN6)、记录时长(5 分钟)、隔音室条件、基因型盲法及分析软件(Avisoft SASLab Pro、VocalMat)
阅读提示:Methods 中 Ultrasonic vocalization assay 小节
SC79 药理 rescue
SC79 剂量(10 mg/kg)、给药时间(E13.0 和 E14.0)、给药方式(腹腔注射)、vehicle 配方及 E19.0 剖宫产
阅读提示:Methods 中 Tamoxifen, EdU and SC79 administration 小节
空间转录组(seqFISH)
胚胎日龄(E14.0)、自定义基因 panel 设计依据、聚类分析方法及对照与突变组比较设计
阅读提示:Methods 中 Spatial transcriptomic analysis (SeqFISH) 小节