患者队列遗传学鉴定与临床表型分析
鉴定导致免疫失调的IRAK2变异并描述患者临床特征。
对12例患者进行WES或WGS，Sanger测序确认IRAK2-∆ex2纯合变异，并回顾性分析临床资料和实验室指标。
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IRAK2缺陷通过Myddosome组装缺陷和增强的干扰素反应导致免疫失调
IRAK2 deficiency causes immune dysregulation through defective Myddosome assembly and enhanced interferon responses.
实验完整度
高含患者样本、细胞系、敲入小鼠及BMDMs多层级证据，并行功能与机制验证
主要模型
12例IRAK2-∆ex2纯合突变患者及其PBMCs HEK293T-TLR4细胞系及IRAK2 KO细胞 PMA分化的THP-1细胞及IRAK2 KO细胞 Irak2∆ex2/∆ex2敲入小鼠及BMDMs
重点核对
患者PBMCs在LPS或R848刺激后NF-κB下游细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-10）mRNA和蛋白诱导水平降低 HEK293T-TLR4细胞中IRAK2-∆ex2过表达不能激活NF-κB和MAPK信号 Irak2∆ex2/∆ex2小鼠BMDMs对多种TLR激动剂刺激的NF-κB相关基因表达缺陷 患者血清IFN-β水平及PBMCs基线p-IRF3水平升高 THP-1 KO细胞中IRAK2-WT回补较EV和IRAK2-∆ex2降低IFN信号，且TRIF敲低或抑制剂可抑制异常IFN反应
摘要
白细胞介素-1受体相关激酶2（IRAK2）对于Toll样受体下游Myddosome复合物的形成至关重要。我们鉴定了12例携带IRAK2纯合功能丧失拷贝数变异的患者，该变异命名为IRAK2-∆ex2。大多数患者表现为反复感染、自身抗体产生和胃肠道溃疡。两名患者被临床诊断为原发性免疫缺陷，而大多数患者符合自身免疫性或自身炎症性疾病的诊断标准。IRAK2-∆ex2蛋白无法与IRAK4相互作用，导致通过Myddosome复合物激活核因子kappa B信号通路受损。在患者中观察到I型干扰素特征升高，并在敲入小鼠的骨髓来源巨噬细胞和敲除细胞系中得到证实。机制上，我们的数据与TRIF依赖性干扰素通路的参与一致。巴瑞替尼在离体患者来源细胞和细胞系中减弱了升高的干扰素特征。在此，我们证明IRAK2缺陷是一种单基因免疫失调疾病。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IRAK2纯合功能丧失变异是否导致免疫失调，以及其通过何种机制影响Myddosome组装和干扰素反应。
- 核心机制
- IRAK2-∆ex2蛋白因缺失外显子2编码的死亡结构域部分而无法与IRAK4相互作用，破坏Myddosome复合物形成，导致NF-κB和MAPK信号激活受损，同时通过TRIF依赖性通路增强I型干扰素反应。
- 主要证据
- 12例患者遗传学和临床分析显示IRAK2-∆ex2纯合变异与免疫失调表型共分离；患者PBMCs、HEK293T-TLR4细胞、THP-1 KO细胞及Irak2∆ex2/∆ex2小鼠BMDMs中NF-κB信号受损；患者血清IFN-β和p-IRF3升高，并在小鼠BMDMs和THP-1细胞中重现；TRIF抑制剂/敲低和TBK1/IKKε抑制剂可抑制升高的IFN反应。
- 研究意义
- 将IRAK2缺陷确定为一种新的单基因免疫失调疾病（DIRAK2），揭示了IRAK2在调控炎症反应和I型干扰素信号中的双重功能，并提示I型干扰素通路可能作为伴自身免疫表现患者的潜在干预方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
IRAK2-∆ex2与IRAK4相互作用及NF-κB信号验证
验证IRAK2-∆ex2是否破坏与IRAK4的相互作用并影响下游信号。
在HEK293T-IRAK2 KO细胞中共转染IRAK2-WT或IRAK2-∆ex2与IRAK4-Flag或TRAF6-Flag进行co-IP，并在HEK293T-TLR4稳定细胞系中过表达后LPS刺激检测NF-κB和MAPK信号。
患者PBMCs中TLR刺激后的细胞因子和信号反应
评估患者细胞对TLR4和TLR7/8刺激的NF-κB依赖反应。
分离患者和对照PBMCs，用LPS或R848刺激后检测细胞因子mRNA和蛋白水平，并进行bulk RNA-seq、CyTOF和scRNA-seq分析。
Irak2∆ex2/∆ex2小鼠体内炎症反应评估
在体内验证Irak2-∆ex2突变对LPS诱导炎症和细菌清除的影响。
构建Irak2∆ex2/∆ex2敲入小鼠，进行高剂量LPS生存分析、亚致死剂量LPS诱导细胞因子检测、E. coli腹腔感染模型评估细菌清除。
I型干扰素特征及TRIF依赖性机制验证
探究IRAK2缺陷是否导致I型干扰素升高及其信号通路。
检测患者血清IFN-β和PBMCs p-IRF3，在BMDMs和THP-1 KO细胞中验证IFNB1表达，使用TRIF抑制剂/敲低、TBK1/IKKε抑制剂和TAK1抑制剂处理，并用巴瑞替尼处理患者PBMCs和THP-1细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子相互作用与信号通路
基因干预与细胞模型构建
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | C11875500BT | |
| 胎牛血清 | Vazyme | F103 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma | M6250 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 小鼠巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | 315-02 | |
| 细胞刺激 | 脂多糖 | Sigma | L6529 |
| R848 | MCE | HY-13740 | |
| FSL-1 | MCE | HY-P2036 | |
| Pam3Cys-Ser-(Lys)4 | Abcam | ab142085-100ug | |
| ODN2006 | Tsingke | -- | |
| 聚肌胞苷酸 | MCE | HY-107202 | |
| 细胞处理 | 巴瑞替尼 | MCE | LY3009104 |
| TIRAP抑制剂 | Novus | NBP2-29331 | |
| TRIF抑制剂 | MCE | HY-P2565 | |
| TBK1/IKKε抑制剂 | MCE | HY-12453 | |
| TAK1抑制剂 | MCE | HY-12686 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 | |
| ProteanFect转染试剂盒 | Nanoportal Biotech | PT01 | |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Beyotime | ST551 |
| THP-1分化 | 佛波酯 | Sigma | P8139 |
| Western blot | cOmplete蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693159001 |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | 04906837001 | |
| BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Fisher | 23225 | |
| 免疫共沉淀 | DYKDDDDK标签纳米磁珠 | AlpVHHS | 016-101-003 |
| 细胞因子检测 | 流式微球阵列 | BD Biosciences | 551811 |
| 血清细胞因子检测 | ABplex小鼠细胞因子15重检测试剂盒 | Abclonal | RK05203 |
| ELISA | Tnf ELISA试剂盒 | Lianke Bio | EK282 |
| Il-10 ELISA试剂盒 | Lianke Bio | EK210 | |
| RNA提取与反转录 | RNeasy微型试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| HiScript III全能反转录预混液 | Vazyme | R333-01 | |
| qPCR | 2×通用SYBR Green快速qPCR预混液 | ABclonal | RK21203 |
| DNA提取 | Maxwell RSC全血DNA试剂盒 | Promega | AS1520 |
| 流式细胞术 | 透化缓冲液III | BD Biosciences | 558050 |
| Alexa Fluor 647标记抗兔IgG(H+L) | Thermo Fisher | a-31573 | |
| Western blot | 磷酸化p65 (Ser536)抗体 | Cell Signaling Technology | #3033 |
| p65抗体 | Cell Signaling Technology | #8242 | |
| 磷酸化p38 (Thr180/Tyr182)抗体 | Cell Signaling Technology | #4511 | |
| p38抗体 | Cell Signaling Technology | #8690 | |
| HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | #3724S | |
| 磷酸化p105 (Ser932)抗体 | Cell Signaling Technology | #4806 | |
| p105抗体 | Cell Signaling Technology | #4717 | |
| 磷酸化JNK (Thr183/Tyr185)抗体 | Cell Signaling Technology | #4668 | |
| JNK抗体 | Cell Signaling Technology | #9252 | |
| IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | #4302 | |
| 磷酸化STAT1 (Tyr701)抗体 | Cell Signaling Technology | #9167 | |
| STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | #14994 | |
| 磷酸化STAT2 (Tyr690)抗体 | Cell Signaling Technology | #88410 | |
| STAT2抗体 | Cell Signaling Technology | #72604 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | #4970 | |
| 磷酸化IKKε (Ser172)抗体 | Cell Signaling Technology | #8766 | |
| IKKε抗体 | Cell Signaling Technology | #2905 | |
| 磷酸化TBK1 (Ser172)抗体 | Cell Signaling Technology | #5483 | |
| TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | #3504 | |
| TRIF抗体 | Cell Signaling Technology | #16809 | |
| Flag标签抗体 | Sigma-Aldrich | MA1-91878 | |
| Myc标签抗体 | Proteintech | 60003-2-Ig | |
| HRP标记GAPDH抗体 | Proteintech | HRP-60004 | |
| Myc标签抗体 | STARTER | S0B0383 | |
| 磷酸化IRF3 (Ser386)抗体 | Abclonal | AP0995 | |
| 流式细胞术 | 磷酸化IRF3 (Ser386)抗体 | CST | #37829 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者PBMCs刺激与细胞因子检测 | LPS浓度（1 μg/mL）、刺激时间（12 h用于CBA，8 h用于scRNA-seq）、细胞密度（1.5×10^6 cells/mL）、R848浓度（文中未明确说明） 阅读提示：Methods 'Cell lines, cell culture, and treatment'及Fig. 2d, e图注 |
| HEK293T-TLR4 NF-κB信号检测 | LPS浓度（1 μg/mL）、刺激时间（文中未明确说明具体时间点）、细胞系构建方式（慢病毒转导TLR4-HA、CD14-Flag、LY96） 阅读提示：Methods 'Cell lines, cell culture, and treatment'及Fig. 2c图注 |
| Irak2∆ex2/∆ex2小鼠LPS反应 | LPS剂量（生存分析20 mg/kg；细胞因子检测10 mg/kg；肝组织学1 mg/kg）、注射途径（腹腔注射）、取样时间（2 h或48 h）、小鼠年龄和性别（如10周龄第七代雌鼠等） 阅读提示：Methods 'Analysis of in vivo response to LPS'及Fig. 3a–d图注 |
| BMDMs TLR刺激与基因表达 | 刺激物浓度（LPS 100 ng/mL、R848 25 ng/mL、FSL-1 50 ng/mL、PAM3 1 μg/mL、ODN2006 2 μM）、刺激时间（8 h）、BMDMs来源小鼠年龄和性别 阅读提示：Methods 'Cell lines, cell culture, and treatment'及Fig. 3h图注 |
| THP-1细胞中TRIF依赖性IFN反应验证 | LPS浓度（10 ng/mL）、刺激时间（2 h）、TRIF抑制剂浓度（10 μM）和预处理时间（2 h）、TBK1/IKKε抑制剂浓度（1 μM）和预处理时间（30 min）、TAK1抑制剂浓度（100 nM）和预处理时间（30 min）、siRNA浓度（200 pmol） 阅读提示：Methods 'Cell lines, cell culture, and treatment'、'siRNA-mediated gene knockdown in THP-1 cells'及Fig. 5c–h图注 |
| 巴瑞替尼处理患者PBMCs和THP-1细胞 | 巴瑞替尼浓度（0.5 μM）、处理时间（12 h）、PBMCs来源患者（P4和P11）及未治疗状态 阅读提示：Methods 'Cell lines, cell culture, and treatment'及Fig. 5i–k图注 |