多组学鉴定Norrin/β-catenin下游靶点
寻找Norrin/β-catenin信号通路抑制后共同下调的关键下游基因。
对HRECs分别敲低CTNNB1、FZD4、TSPAN12或LRP5后进行bulk RNA-seq，结合WGCNA、KEGG和PPI网络分析鉴定核心下调基因KIF11，并用RT-qPCR和Western blot验证。
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KIF11通过抑制磷酸化驱动的PRDX1相分离阻止家族性渗出性玻璃体视网膜病变中的视网膜内皮细胞铁死亡
KIF11 prevents retinal endothelial ferroptosis in familial exudative vitreoretinopathy by inhibiting phosphorylation-driven PRDX1 phase separation.
实验完整度
高包含体外HRECs/HEK293T/HT1080模型、内皮特异性基因敲除小鼠模型及FEVR患者样本，并有功能回补和机制验证。
主要模型
人视网膜微血管内皮细胞（HRECs） HEK293T细胞与HT1080细胞 内皮细胞特异性Ctnnb1/Kif11条件敲除小鼠 FEVR患者外周血基因组DNA样本
重点核对
HRECs中CTNNB1、FZD4、TSPAN12或LRP5敲低后KIF11的mRNA和蛋白下调（n=3） Ctnnb1 cKO小鼠经视网膜后眶静脉窦注射KIF11过表达慢病毒（20 μL，1×10^9 TU/mL）后视网膜血管进展部分恢复（n=8） KIF11敲低HRECs中GPX4、xCT、PCBP1、SLC3A2蛋白下调及ACSL4、HO-1上调（n=3） KIF11敲低HRECs中PRDX1 Tyr194磷酸化升高及HMW二聚体增加，PP1（100 μM）或larotinib（100 μM）处理可逆转（n=3） Kif11 cKO和Ctnnb1 cKO小鼠从P2至P6每日腹腔注射Fer-1（30 mg/kg）后P7视网膜血管缺陷部分挽救（n=8）
摘要
家族性渗出性玻璃体视网膜病变是一种主要影响婴幼儿的遗传性疾病，常导致严重视力丧失。约40%的患者携带Norrin/β-catenin通路基因突变。然而，其下游致病机制尚不清楚。本研究通过bulk RNA测序和单细胞RNA测序分析，鉴定出KIF11是视网膜内皮细胞中的关键下游效应因子。慢病毒介导的KIF11过表达可部分恢复内皮细胞特异性Ctnnb1敲除小鼠的血管缺陷。功能和多组学研究揭示，β-catenin/KIF11缺陷诱导自噬伴随的铁死亡。机制上，KIF11与PRDX1结合，被破坏的β-catenin/KIF11轴释放了KIF11对Src介导的PRDX1磷酸化的竞争性抑制，触发随后的液-液相分离。使用铁死亡抑制剂ferrostatin-1或慢病毒过表达不可磷酸化的PRDX1可部分挽救家族性渗出性玻璃体视网膜病变相关小鼠的血管缺陷。总之，我们阐明了家族性渗出性玻璃体视网膜病变中依赖β-catenin/KIF11/PRDX1轴的铁死亡机制，强调靶向铁死亡和抗氧化策略作为潜在疗法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Norrin/β-catenin信号通路下游的关键效应因子是什么，其如何导致家族性渗出性玻璃体视网膜病变的视网膜血管发育缺陷。
- 核心机制
- β-catenin/KIF11轴缺陷释放KIF11对Src介导PRDX1 Tyr194磷酸化的竞争性抑制，触发PRDX1液-液相分离并抑制其过氧化物酶活性，进而诱导自噬伴随的铁死亡，最终损害视网膜血管化。
- 主要证据
- bulk RNA-seq和scRNA-seq鉴定KIF11为下游靶点；HRECs、HEK293T和HT1080细胞中敲低KIF11/PRDX1/CTNNB1诱导铁死亡标志物变化；Co-IP、FRAP、非还原SDS-PAGE和miniTurboID邻近标记验证KIF11-PRDX1-Src机制；Kif11 cKO和Ctnnb1 cKO小鼠中Fer-1或Y194Q PRDX1慢病毒部分挽救血管缺陷。
- 研究意义
- 揭示β-catenin/KIF11/PRDX1轴依赖的铁死亡机制在FEVR发病中的作用，提示靶向铁死亡或恢复PRDX1功能可能作为FEVR及其他血管疾病的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组解析Kif11在内皮细胞中的表达
明确Kif11在视网膜内皮细胞亚群及Norrin/β-catenin失活条件下的表达特征。
对P6 WT、Ctnnb1 cKO和Tspan12 KO小鼠视网膜血管细胞进行scRNA-seq，整合公共数据集，分析Kif11在内皮细胞亚群中的表达；并用RT-qPCR和Western blot检测不同发育时间点视网膜KIF11水平。
KIF11功能回补验证其下游效应因子地位
检验恢复KIF11能否挽救Ctnnb1 cKO小鼠的视网膜血管缺陷。
通过视网膜后眶静脉窦注射KIF11过表达慢病毒，观察P7 Ctnnb1 cKO小鼠视网膜血管进展和血管密度。
KIF11缺失诱导内皮细胞自噬伴随铁死亡
确定KIF11缺失对HRECs增殖、死亡及铁死亡相关通路的影响。
用shRNA慢病毒敲低HRECs中KIF11，进行RTCA、EdU、TUNEL、TEM、转录组和蛋白质组分析，检测GPx活性、亚铁离子、MDA、BODIPY、CellROX及铁死亡相关蛋白；并用Fer-1处理验证挽救效应。
KIF11与PRDX1相互作用及相分离验证
探究KIF11是否通过结合PRDX1调控其相分离。
在KIF11-FLAG过表达HRECs中进行免疫沉淀-质谱鉴定结合蛋白，Co-IP验证KIF11-PRDX1互作；免疫荧光观察PRDX1斑点，FRAP和1,6-HD处理验证液-液相分离，非还原SDS-PAGE检测PRDX1二聚体。
Src介导PRDX1磷酸化驱动相分离的机制验证
验证KIF11通过竞争性结合抑制Src对PRDX1 Tyr194的磷酸化，进而影响PRDX1相分离。
检测KIF11敲低后PRDX1 Tyr194磷酸化水平；过表达Y194Q突变体观察PRDX1斑点和二聚体变化；使用larotinib（100 μM）和PP1（100 μM）抑制磷酸化；miniTurboID邻近标记检测Src-PRDX1互作及KIF11过表达的影响。
PRDX1和CTNNB1缺失表型及Fer-1挽救
验证PRDX1缺失是否模拟KIF11缺失表型，以及CTNNB1缺失是否通过PRDX1磷酸化/相分离诱导铁死亡。
在HRECs中敲低PRDX1或CTNNB1，检测增殖、死亡、自噬和铁死亡指标；用Fer-1处理观察挽救效果；检测CTNNB1敲低后PRDX1磷酸化和相分离变化。
体内Kif11敲除导致视网膜血管发育缺陷及铁死亡信号
在体内验证内皮细胞Kif11缺失对 retinal 血管发育和铁死亡/自噬信号的影响。
构建Kif11 cKO小鼠，观察P7和P10视网膜血管进展、血管密度、血管渗漏及TEM超微结构；检测肺组织PRDX1 Tyr194磷酸化、自噬和铁死亡相关蛋白。
Fer-1或非磷酸化PRDX1体内回补实验
检验抑制铁死亡或恢复PRDX1功能能否挽救FEVR相关小鼠模型的血管缺陷。
对Kif11 cKO和Ctnnb1 cKO小鼠从P2至P6每日腹腔注射Fer-1；或通过后眶静脉窦注射表达PRDX1-WT或PRDX1-Y194Q的慢病毒，观察P7视网膜血管。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 人视网膜微血管内皮细胞 | Cell-systems | ACBRI-181 |
| 完全经典培养基 | Cell-systems | 4Z0-500 | |
| DMEM培养基 | Gibco | 11995040 | |
| 胎牛血清 | VivaCell | C04001-500 | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| 动物实验 | 他莫昔芬 | Topscience | T6906 |
| 铁死亡抑制剂Fer-1 | Med Chem Express | HY-100579 | |
| 细胞处理 | 铁死亡抑制剂Fer-1 | Med Chem Express | HY-100579 |
| Norrin蛋白 | R&D | 3014-NR-025 | |
| 脂质过氧化检测 | 脂质过氧化荧光探针 | Thermo Fisher Scientific | B3939 |
| 细胞死亡检测 | Annexin V | Thermo Fisher Scientific | A35122 |
| 碘化丙啶 | Med Chem Express | HY-D0815 | |
| EdU检测 | EdU成像试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10339 |
| TUNEL检测 | TUNEL凋亡检测试剂盒 | YEASEN | 40308ES20 |
| ROS检测 | CellROX深红ROS探针 | Life Technologies | C10422 |
| 亚铁离子检测 | 亚铁离子荧光探针 | DOJINDO | F374 |
| LDH释放检测 | 细胞毒性LDH检测试剂盒 | MedChenExpress | HY-K1090 |
| MDA检测 | 丙二醛检测试剂盒 | Beyotime | S0131S |
| GPx活性检测 | 谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒 | Beyotime | S0055S |
| 质粒转染 | 脂质体3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| 相分离破坏 | 1,6-己二醇 | Sigma | 240117 |
| 核染色 | Hoechst核染料 | Beyotime | C1027 |
| RNA提取 | RNA提取试剂 | Transgen Biotech | ET101-01-V2 |
| RT-PCR | 一步法RT-PCR预混液 | TransGen Biotech | AT411-02 |
| RT-qPCR | qPCR预混液 | TransGen Biotech | AQ142-21 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| 上样缓冲液 | Solarbio | P1040 | |
| 化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| 免疫荧光 | Isolectin GS-IB4 | Invitrogen | I21413 |
| Isolectin GS-IB4 | Invitrogen | I21411 | |
| Alexa Fluor 488链霉亲和素 | Thermo Fisher Scientific | S11223 | |
| 水性封片剂 | Merck | F4680 | |
| 血管渗漏检测 | Sulfo-NHS-生物素 | Thermo Fisher Scientific | 21217 |
| 单细胞测序 | CD31磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-097-418 |
| CD11b磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-126-725 | |
| 单细胞3'文库构建试剂盒 | 10× Genomics | -- | |
| 靶向测序 | DNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| 捕获试剂盒 | MyGenostics | OT004/OT021A | |
| Co-IP | 抗FLAG磁珠 | Med Chem Express | HY-K0207 |
| 邻近标记 | 链霉亲和素磁珠 | Med Chem Express | HY-K0208 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型构建与诱导 | Kif11-flox（S-CKO-03251, Cyagen）和Ctnnb1-flox（VSM4101958, Viewsolid）品系；Pdgfb-iCre-ER诱导；他莫昔芬50 μg每日腹腔注射，P1起连续3天 阅读提示：Methods-Mice小节 |
| 慢病毒后眶静脉窦注射 | 慢病毒20 μL，滴度1×10^9 TU/mL；P1小鼠异氟烷麻醉；31 G针约40°角；GFP荧光判断转导效率 阅读提示：Methods-Mice小节及Supplementary Fig. 3j |
| Fer-1体内处理 | Fer-1 30 mg/kg，每日腹腔注射，P2至P6；对照DMSO；P7检测视网膜血管 阅读提示：Methods-Mice小节及Fig. 9a |
| HRECs培养与敲低 | HRECs（ACBRI-181）培养于完全经典培养基（4Z0-500）；shRNA慢病毒来自Genechem；shRNA序列见Supplementary Table 4 阅读提示：Methods-Cell culture小节及Supplementary Table 4 |
| 铁死亡/相分离抑制剂处理 | Fer-1 4 μM（慢病毒感染后24 h加入）；larotinib 100 μM；PP1 100 μM；1,6-HD 10% 阅读提示：Methods-Cell culture、FRAP及相应Figure legends |
| scRNA-seq样本与数据分析 | P6 WT、Ctnnb1 cKO、Tspan12 KO每窝5只小鼠视网膜；CD31/CD11b磁珠富集；10× Genomics 3’ v3.1建库；公共数据集GSE175895、GSE213887、GSE125708；质控标准（<250基因、<500 UMI、>15%线粒体reads剔除） 阅读提示：Methods-Retinal vascular cell isolation and Single-cell RNA-sequencing小节 |
| 患者样本与基因测序 | FEVR患者6例（5男1女，4–53月龄）；诊断标准；QIAamp DNA Mini Kit提取外周血gDNA；Illumina Nextseq 500测序；Sanger验证引物见Supplementary Table 3 阅读提示：Methods-Patient recruitment and clinical evaluation、Targeted gene sequencing and Sanger sequencing小节 |