临床样本采集与组织病理学评估
在组织学层面评估成纤维细胞和内皮细胞在剖宫产切口愈合中的作用。
采集Adjacent、Control、Niche三组组织，进行H&E染色、Masson三色染色和苦味酸-天狼星红染色，观察血管形态和胶原沉积。
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CTGF-LRP1在剖宫产切口愈合不良中的作用
Role of CTGF-LRP1 in impaired healing of cesarean section incisions.
实验完整度
高包含单细胞测序、体外功能验证、siRNA机制验证、组织染色验证及大鼠在体模型治疗验证
主要模型
人剖宫产憩室邻近肌层组织（Adjacent） 人愈合良好剖宫产瘢痕组织（Control） 人剖宫产憩室组织（Niche） 大鼠子宫瘢痕模型
重点核对
人子宫成纤维细胞（HUF）中LRP1 siRNA敲低后rhCTGF处理48小时，检测Collagen I/III及p-ERK、p-β-catenin rhCTGF处理剂量依赖性检测Adjacent、Control、Niche来源成纤维细胞胶原I/III产生 PD98059（MEK1抑制剂）或C16-PAF（ERK1/2激活剂）与rhCTGF联用验证ERK/WNT通路介导胶原合成 大鼠子宫瘢痕模型rhCTGF 0.1 µg/kg腹腔注射隔日一次，第14天和第30天检测子宫肌层再生和胶原沉积 组织IHC验证LRP1和CTGF在愈合组（n=30）与非愈合组（n=30）中的表达差异
摘要
剖宫产憩室（niche），也称为剖宫产瘢痕缺损，是剖宫产的长期并发症，其发病机制尚不完全清楚。在此，我们使用单细胞RNA测序分析了来自剖宫产憩室邻近肌层组织（Adjacent，n=48,587）、愈合良好的剖宫产瘢痕组织（Control，n=47,653）和憩室组织（Niche，n=39,553）的135,793个单个细胞。我们在憩室组织中发现了一个特定成纤维细胞亚群中LRP1的缺陷，这与细胞外基质（ECM）合成能力降低相关。通过体外实验，我们证明LRP1缺陷抑制CTGF有效激活成纤维细胞中的ERK和WNT信号通路，从而损害其功能。组织染色（30例愈合不良 vs 30例愈合良好组）验证了我们的发现，显示愈合不良组中LRP1表达降低。在大鼠子宫瘢痕模型中，重组人CTGF（rhCTGF）治疗促进了子宫肌层再生并增强了子宫成纤维细胞中的胶原产生。我们的分析为剖宫产切口愈合不良的微环境提供了深入见解，并确定了参与憩室形成的关键细胞类型和信号通路。这些结果可能为预测和治疗憩室提供新的预后方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 剖宫产切口愈合不良及憩室形成的细胞和分子机制是什么，CTGF-LRP1轴是否参与调控？
- 核心机制
- Niche FB3成纤维细胞中LRP1表达降低，导致CTGF无法有效激活ERK和WNT信号通路，进而抑制胶原I/III合成和ECM产生，损害切口愈合。
- 主要证据
- scRNA-seq鉴定FB3亚群及其LRP1低表达；体外siLRP1敲低实验证明LRP1缺失阻断CTGF诱导的ERK磷酸化和WNT通路激活及胶原合成；大鼠子宫瘢痕模型中rhCTGF促进肌层再生和胶原产生；临床样本IHC验证CTGF和LRP1在非愈合组表达降低并具预测价值。
- 研究意义
- 为剖宫产切口愈合不良的微环境提供深入见解，确定参与憩室形成的关键细胞类型和信号通路，提示CTGF和LRP1可作为预后生物标志物及潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞RNA测序解析细胞异质性
在单细胞分辨率分析剖宫产憩室组织的细胞组成和调控变化。
对15例新鲜组织进行酶解消化，制备单细胞转录组文库并测序，经质控后获得135,793个细胞，使用Harmony整合、UMAP聚类和经典标记基因鉴定细胞类型。
成纤维细胞亚群鉴定与ECM合成能力分析
探究成纤维细胞异质性，明确哪一亚群在憩室形成中ECM合成受损。
对成纤维细胞进行二次聚类，鉴定FB1、FB2、FB3三个亚群，通过标记基因、GO富集和GSVA分析ECM合成能力，并用免疫荧光验证亚群存在。
内皮细胞亚群鉴定与活化状态分析
解析内皮细胞异质性及其在憩室组织中的活化状态。
对内皮细胞进行亚群聚类，鉴定Endo1、Endo2、Endo3，通过GO富集和Monocle2拟时序分析内皮细胞活化轨迹，并用多重免疫荧光验证。
细胞间通讯分析鉴定CTGF-LRP1配受体对
识别参与剖宫产切口愈合的主要细胞类型及其配体-受体相互作用。
使用CellChat和iTALK分析细胞间通讯，聚焦CTGF信号通路，鉴定Endo3为信号发送者、FB3为接收者，并分析CTGF受体LRP1、LRP6和ITGA5的表达。
体外功能验证LRP1对CTGF诱导胶原合成的影响
验证LRP1在CTGF诱导成纤维细胞胶原合成和ECM重塑中的作用。
从Adjacent、Control、Niche组织分离成纤维细胞，给予rhCTGF处理检测胶原I/III；在HUF中转染LRP1 siRNA或对照siRNA后给予rhCTGF，检测胶原合成及ERK/WNT通路变化。
通路干预验证ERK/WNT介导机制
验证ERK/WNT通路在LRP1介导的CTGF促胶原合成中的因果作用。
在HUF和患者来源成纤维细胞中，使用MEK1抑制剂PD98059或ERK1/2激活剂C16-PAF与rhCTGF联用，检测胶原I/III和p-β-catenin表达。
临床样本验证CTGF-LRP1预测愈合程度
评估CTGF和LRP1表达与经阴道憩室修补术后切口愈合程度的关系及预测价值。
收集经阴道手术中的憩室样本，根据MRI表现、临床症状和文献标准定义愈合组与非愈合组，进行CTGF和LRP1的IHC染色、相关性分析和ROC分析。
大鼠子宫瘢痕模型体内验证rhCTGF疗效
在体内评估rhCTGF对子宫切口愈合的治疗潜力。
建立大鼠子宫瘢痕模型，随机分为Sham、PBS和rhCTGF组，术后隔日腹腔注射，第14天和第30天取材，通过H&E、α-SMA IHC和Masson染色评估肌层再生和胶原沉积。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织保存 | 组织保存液 | Miltenyi | 130-100-008 |
| 组织染色 | Masson染色试剂盒 | Yeason | 60532ES74 |
| 天狼星红染色试剂盒 | Solarbio | G1462 | |
| 单细胞悬液制备 | I型胶原酶 | Gibco | 17100017 |
| II型胶原酶 | Gibco | 17101015 | |
| 100 µm细胞筛网 | BIOFIL | CSS-013-100 | |
| 红细胞裂解液 | Beyotime Biotech | C3702 | |
| 单细胞测序 | Chromium控制器 | 10X Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| 免疫荧光 | 荧光标记试剂盒 | RecordBio Biological Technology | RC0085 |
| 荧光标记试剂盒 | RecordBio Biological Technology | RC0086-23RM | |
| 兔单克隆抗PDGFRA抗体 | Abcam | ab203491 | |
| 兔单克隆抗CD10抗体 | Cell Signaling Technology | E5P7S | |
| 兔多克隆抗C7抗体 | Atlas Antibodies AB | HPA001465 | |
| 鼠单克隆抗PECAM1抗体 | Abcam | ab182981 | |
| 兔多克隆抗CXCL12抗体 | Proteintech | 17402-1-AP | |
| 兔多克隆抗EGR1抗体 | Proteintech | 22008-1-AP | |
| 兔多克隆抗LRP1抗体 | Abclonal | A1439 | |
| 兔多克隆抗CTGF抗体 | Abclonal | A11456 | |
| DAPI | Beyotime | -- | |
| 免疫组化 | 兔多克隆抗LRP1抗体 | Abclonal | A1439 |
| 兔多克隆抗C7抗体 | Atlas Antibodies AB | HPA001465 | |
| 兔多克隆抗CTGF抗体 | Abclonal | A11456 | |
| 兔多克隆抗αSMA抗体 | Proteintech | 14395-1-AP | |
| 兔多克隆抗EGR1抗体 | Proteintech | 22008-1-AP | |
| 兔特异性HRP/DAB检测免疫组化试剂盒 | RecordBio Biological Technology | RC0080R | |
| 细胞培养与处理 | 重组人CTGF | MCE | HY-P70106 |
| PD98059（MEK/ERK抑制剂） | MCE | HY-12028 | |
| C16-PAF（MEK/ERK激动剂） | MCE | HY-108635 | |
| siRNA转染 | JetPRIME转染试剂 | Polyplus | 101000046 |
| RT-qPCR | RNA Isolator总RNA提取试剂 | Vazyme | R401-01 |
| HiScript II Q RT SuperMix逆转录试剂盒 | Vazyme | R223-01 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711-02 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Epizyme | PC101 |
| Bradford蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0006 | |
| 兔多克隆抗I型胶原抗体 | Proteintech | 14695-1-AP | |
| 兔多克隆抗III型胶原抗体 | Proteintech | 22734-1-AP | |
| 兔单克隆抗LRP1抗体 | Abclonal | A0633 | |
| 兔多克隆抗磷酸化ERK1/2抗体 | Proteintech | 28733-1-AP | |
| 兔多克隆抗ERK1/2抗体 | Proteintech | 11257-1-AP | |
| 兔单克隆抗磷酸化β-catenin抗体 | Proteintech | 80067-1-RR | |
| 纯化鼠抗β-catenin抗体 | BD biosciences | 610154 | |
| 鼠抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 增强化学发光试剂盒 | Epizyme | SQ201 | |
| RNA测序 | VAHTS Universal V6 RNA-seq文库构建试剂盒 | Vazyme | NR604-01 |
| DNBSEQ-T7测序平台 | -- | -- | |
| 动物实验 | 三溴乙醇 | -- | -- |
| 多粘菌素B | -- | -- | |
| 新霉素三硫酸盐 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞RNA测序样本与质控 | 每组n=5，总细胞数135,793；线粒体基因比例>20%和血红蛋白基因>2%的细胞被过滤；酶解使用0.1%胶原酶I和0.1%胶原酶II，37 °C 40-60分钟 阅读提示：Methods中Single cell suspension preparation、Single cell cDNA library preparation and sequencing、ScRNA-seq data analysis小节；Fig. 2a |
| 成纤维细胞亚群鉴定 | FB1/FB2/FB3标记分别为PDGFRA+CD10+C7-、PDGFRA+CD10-C7-、PDGFRA+CD10-C7+；免疫荧光每组n=3；扩增阈值adjusted P<0.05、fold-change>1.2 阅读提示：Fig. 3a–f及对应图注；Methods中Differential expression and enrichment analysis小节 |
| 体外LRP1敲低与rhCTGF处理 | siRNA终浓度50 nM，转染48小时后rhCTGF处理48小时；RNA测序中rhCTGF浓度为10 ng/ml；三次独立重复实验 阅读提示：Methods中Cell culture and siRNA transfection、Construction of RNA sequencing libraries and sequencing小节；Fig. 6a、Fig. 6c |
| 通路抑制剂/激活剂干预 | PD98059和C16-PAF的具体使用浓度文中未明确说明；处理时间为48小时 阅读提示：Methods中Cell culture and siRNA transfection小节；Fig. 6i–j |
| 大鼠子宫瘢痕模型与rhCTGF给药 | 雌性SD大鼠250-300 g；30只大鼠60个子宫角随机分Sham/PBS/rhCTGF三组，每组20个子宫角；rhCTGF 0.1 µg/kg溶于1 ml PBS隔日腹腔注射；术后第14天和第30天取材；水中添加多粘菌素B 40 mg/L和新霉素三硫酸盐1 g/L持续14天 阅读提示：Methods中Animal experiment小节；Fig. 8a–e |
| 临床样本IHC预测分析 | 愈合组n=30、非愈合组n=30；愈合定义为子宫切口肌层凹陷<2 mm且术后月经持续时间≤7天；随访3、6、9、12个月；每张切片随机选5个视野×400倍计算阳性信号百分比 阅读提示：Results中CTGF-LRP1 could be used to predict the degree of healing小节；Methods中Immunochemical staining (IHC)小节；Fig. 7a–d |