HGSOC多部位单细胞图谱构建
解析HGSOC转移过程中不同时空解剖部位的肿瘤生态系统异质性。
对17例患者的34份样本进行scRNA-seq，涵盖实体瘤、腹水、腹腔灌洗液及正常对照，并进行PCA和Ro/e分析。
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缺氧驱动的SELENOP+巨噬细胞重塑塑造T细胞动态并促进卵巢癌转移
Hypoxia-driven remodeling of SELENOP+ macrophages shapes T cell dynamics and promotes ovarian cancer metastasis.
实验完整度
高多组学（scRNA-seq、scTCR-seq、ST、WES、bulk RNA-seq）、类器官及原位同种移植模型，含功能与机制验证
主要模型
HGSOC患者多部位样本（实体瘤、腹水、腹腔灌洗液） 卵巢癌细胞系（OVCAR3、CAOV3、COV362、ID8）及THP-1、BMDMs、MDMs 患者来源类器官（PDOs） ID8-luciferase原位卵巢癌C57BL/6J小鼠模型
重点核对
ID8-luciferase细胞（3×10^6）注射至C57BL/6J小鼠右侧卵巢囊下建立原位模型 抗VEGFA抗体2.5 mg/kg腹腔注射，每周两次，持续5周（或2周） 缺氧条件：2% O2处理24、48、72 h（细胞系）或72、96 h（PDOs） SELENOP处理：rmSELENOP 25–500 ng/mL处理OT-1 T细胞48 h VEGFA刺激：重组人/鼠VEGFA 50 ng/mL处理48 h，或抗VEGFA中和抗体50 µg/mL
摘要
高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的特征是广泛的经体腔播散和腹水积聚。然而，部位特异性肿瘤微环境（TME）如何驱动疾病进展仍不清楚。在此，我们展示了SELENOP+巨噬细胞与前体耗竭CD8+ T细胞的共现和空间共定位，并证明SELENOP+巨噬细胞在体外和体内通过硒蛋白P激活T细胞。我们进一步发现，随着肿瘤转移，SELENOP+/SPP1+巨噬细胞群体发生动态转变，这是由缺氧恶性上皮细胞通过VEGFA-EPHB2信号驱动所致。我们还揭示，抗VEGFA干预在体内通过增加SELENOP+巨噬细胞和CD8+ T细胞的细胞毒性来控制卵巢肿瘤生长。总之，这些发现强调了肿瘤诱导的TME重塑在颠覆免疫介导的肿瘤控制并从而促进女性HGSOC转移中的作用。总之，我们的结果为开发旨在阻止HGSOC转移轨迹的靶向治疗干预提供了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HGSOC转移过程中，部位特异性肿瘤微环境如何驱动疾病进展，尤其是免疫与恶性细胞间的相互作用机制。
- 核心机制
- 缺氧驱动的恶性上皮细胞通过VEGFA-EPHB2信号重编程SELENOP+巨噬细胞，降低其SELENOP表达，进而损害前体耗竭CD8+ T细胞的细胞毒性功能，促进HGSOC转移。
- 主要证据
- scRNA-seq、scTCR-seq、空间转录组和mIHC显示SELENOP+巨噬细胞与CD8+GZMH+ Tpex共定位且随转移减少；体外共培养和类器官实验证实VEGFA经EPHB2抑制巨噬细胞SELENOP表达；体内抗VEGFA治疗增加SELENOP+巨噬细胞和CD8+ T细胞毒性并减少肿瘤负荷。
- 研究意义
- 为HGSOC转移的免疫抑制微环境形成提供机制见解，并提示靶向VEGFA或EPHB2以重塑免疫微环境、抑制转移的潜在联合免疫治疗方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CD8+ T细胞亚群鉴定与功能状态分析
明确HGSOC转移过程中CD8+ T细胞功能状态和分化轨迹的变化。
对CD8+ T细胞进行无监督聚类，结合scTCR-seq分析克隆扩增和状态转换，并进行拟时序分析。
SELENOP+巨噬细胞与Tpex的空间共定位及预后分析
验证SELENOP+巨噬细胞与CD8+GZMH+ Tpex的空间关联及其临床意义。
利用空间转录组（Stereo-seq和10x Visium）和mIHC检测SELENOP+巨噬细胞与Tpex的共定位，并用TCGA-OV队列进行生存分析。
SELENOP+巨噬细胞调控CD8+ T细胞毒性的体外功能验证
验证SELENOP+巨噬细胞通过SELENOP增强Tpex细胞毒性功能。
使用rmSELENOP处理OT-1 T细胞，或使用过表达/敲低Selenop的BMDMs条件培养基与OT-1 T细胞共培养，检测GZMB、PRF1表达和肿瘤细胞杀伤能力。
缺氧恶性上皮细胞通过VEGFA-EPHB2重编程SELENOP+巨噬细胞的机制验证
验证缺氧驱动的恶性上皮细胞通过VEGFA-EPHB2信号抑制巨噬细胞SELENOP表达。
用缺氧处理的卵巢癌细胞系条件培养基刺激THP-1或BMDMs，结合VEGFA中和抗体、EPHB2敲除/敲低及重组VEGFA处理，检测SELENOP表达；并用PDOs条件培养基处理MDMs验证。
抗VEGFA治疗的体内效果及SELENOP+巨噬细胞依赖性验证
评估抗VEGFA治疗对卵巢肿瘤生长和免疫微环境的影响，并验证巨噬细胞来源SELENOP的作用。
建立ID8-luciferase原位卵巢癌小鼠模型，给予抗VEGFA抗体或IgG对照，检测肿瘤负荷、腹膜转移及免疫细胞比例；并进行过继转移BMDMs或BMDMs-KD1-Selenop实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本保存 | MACS组织保存液 | Miltenyi Biotec | 130-100-008 |
| 组织消化 | 人肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-929 |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | C11875500BT |
| 细胞过滤 | 70 μm细胞筛网 | Corning | 352350 |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解液 | Solarbio | R1010 |
| 细胞活力检测 | 吖啶橙/碘化丙啶 | Nexcelom Bioscience | CS2-0106-5ML |
| 单细胞RNA文库构建 | Chromium Next GEM单细胞3ʹ试剂盒v3.1 | 10x Genomics | PN-1000123 |
| Chromium Next GEM Chip G单细胞试剂盒 | 10x Genomics | PN-1000120 | |
| THP-1分化 | 佛波酯 | Solarbio | P6741 |
| BMDM诱导 | 巨噬细胞集落刺激因子 | Genscript | Z03275 |
| PBMC培养 | 重组人巨噬细胞集落刺激因子 | Novoprotein | CR97 |
| CD8+ T细胞分离 | MojoSort™小鼠CD8 T细胞分离试剂盒 | Biolegend | 480035 |
| MojoSort™人CD8 T细胞分离试剂盒 | Biolegend | 480129 | |
| T细胞激活 | 抗小鼠CD3抗体 | Biolegend | 100339 |
| 抗人CD3抗体 | Biolegend | 300331 | |
| 抗小鼠CD28抗体 | Biolegend | 102115 | |
| 抗人CD28抗体 | Biolegend | 302933 | |
| T细胞培养 | 小鼠白细胞介素-2 | Proteintech | Eg0456 |
| 人白细胞介素-2 | Proteintech | HZ-1015 | |
| T细胞刺激 | 卵清蛋白肽（257-264） | Sangon Biotech | T510212 |
| T细胞处理 | 重组小鼠SELENOP | Elabscience | PDMM100013 |
| 慢病毒转染 | 聚凝胺 | Hanbio | HB-PB-500 |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Solarbio | P8230 |
| 巨噬细胞刺激 | 重组人IFNγ蛋白 | Novoprotein | C014 |
| 重组小鼠IFNγ蛋白 | Novoprotein | C746 | |
| 重组人VEGFA | Novoprotein | GMP-CR96 | |
| 重组小鼠VEGFA | Novoprotein | CX73 | |
| ELISA | 人SELENOP ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H2177 |
| 小鼠SELENOP ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M3044 | |
| VEGFA中和 | 抗人VEGFA中和抗体 | MedChemExpress | HY-P9906 |
| 抗小鼠VEGFA中和抗体 | BioLegend | 512810 | |
| 类器官培养 | IV型胶原酶 | Thermo | 17104019 |
| 基质胶 | Corning | 356231 | |
| advanced DMEM/F12培养基 | Invitrogen | 12634028 | |
| B27添加剂 | Thermo | 17504-044 | |
| 表皮生长因子 | PeproTech | AF-100-15 | |
| 成纤维细胞生长因子10 | PeproTech | 100-26 | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma | A9165 | |
| 烟酰胺 | Sigma | N0636 | |
| A8301 | Tocris | 2939 | |
| 佛司可林 | R&D | 1099 | |
| GlutaMAX添加剂 | Thermo | 35050-061 | |
| Primocin抗生素 | Invivogen | ant-pm1 | |
| HEPES缓冲液 | Gibco | 15630080 | |
| Y27632 | Selleck | S1094 | |
| 体内对照治疗 | IgG对照抗体 | Bioxcell | BE0089 |
| 体内抗VEGFA治疗 | 抗VEGFA抗体 | BioLegend | 512810 |
| mIHC | 山羊抗小鼠/兔多重IHC检测试剂盒 | zenbio | 18006 |
| 抗CD8a抗体 | Abmart | PAQ6570 | |
| 抗PD1抗体 | Abmart | PH9964 | |
| 抗GZMH抗体 | Bioworld | BS2543 | |
| 抗SPP1抗体 | Abcam | ab63856 | |
| 抗SELENOP抗体 | Invitrogen | PA5-112707 | |
| 抗HIF-1α抗体 | Abmart | PU774605 | |
| 抗CD68抗体 | Abcam | ab283654 | |
| 抗Panck抗体 | MXB Biotechnologies | RAB-0050 | |
| 抗F4/80抗体 | Cell Signaling Technology | 30325T | |
| mIHC成像 | 多通道激光共聚焦显微镜 | Nikon | AXR |
| Microsystems | Leica | 605025 | |
| ELISA检测 | 酶标仪 | TECAN | Infinite M200Pro |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞RNA-seq样本采集与处理 | 样本来源（17例患者34份样本，8个解剖部位）、组织消化时间40 min、细胞活力>85%、上样浓度800–1200 cells/µL 阅读提示：Methods中Patient samples and ethics statement及Sample collection and single-cell suspension processing小节 |
| SELENOP+巨噬细胞与Tpex共培养功能验证 | rmSELENOP浓度梯度（25、50、75、100、250、500 ng/mL）、处理时间48 h、OT-1 T细胞激活条件（anti-CD3 2 µg/mL、anti-CD28 0.5 µg/mL处理2天） 阅读提示：Methods中T cell isolation and SELENOP treatment assay小节及Supplementary Fig. 4 |
| VEGFA-EPHB2机制验证 | 缺氧条件2% O2、处理时间24/48/72 h（细胞系）或72/96 h（PDOs）、重组VEGFA 50 ng/mL处理48 h、VEGFA中和抗体50 µg/mL 阅读提示：Methods中Selenite pretreatment, IFNγ stimulation and VEGFA treatment assay及Cancer cells and macrophages coculture system小节 |
| 体内抗VEGFA治疗实验 | ID8-luciferase细胞3×10^6注射至卵巢囊下、抗VEGFA抗体2.5 mg/kg腹腔注射每周两次持续5周、第49天处死、每组n=9 阅读提示：Methods中Tumor model and treatment小节及Fig. 7a图注 |
| 过继转移实验 | BMDMs或BMDMs-KD1-Selenop 3×10^6细胞腹腔注射、抗VEGFA抗体2.5 mg/kg每周两次持续2周、转移后14天取材 阅读提示：Methods中Tumor model and treatment小节及Supplementary Fig. 14a图注 |