LRBA与CTLA4在临床样本中的表达关联分析
评估LRBA与CTLA4在人类结直肠癌中的表达关系及其与免疫细胞浸润和患者生存的关联。
对94例结直肠癌患者肿瘤及癌旁组织进行IHC染色，计数LRBA+与CTLA4+细胞；利用TIMER2.0、XCELL和TIDE分析TCGA等公共数据集中LRBA与免疫浸润及生存的关联。
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靶向LRBA触发CTLA4降解并增强抗肿瘤免疫用于癌症免疫治疗
Targeting LRBA triggers CTLA4 degradation and antitumor immunity for cancer immunotherapy.
实验完整度
高含患者组织芯片、LRBA-/-与Ctla4+/-小鼠、多肿瘤模型、细胞与分子机制验证及scRNA-seq
主要模型
结直肠癌患者肿瘤与癌旁组织芯片（n=94） MC38及CT26结直肠癌皮下/原位小鼠模型 B16-GMCSF黑色素瘤小鼠模型 HEK293T细胞过表达系统与人PBMC
重点核对
LC427口服30 mg/kg每日一次，第4至21天给药 LC427体外浓度梯度0、5、10、20 μM处理3–5天 LRBA PH结构域突变N2349D消除LC427对LRBA-CTLA4相互作用的影响 shLrba或Ctla4-/- T细胞逆转LC427的抗肿瘤效应 DSS诱导结肠炎模型中LC427与anti-CTLA4 mAb的irAE对比
摘要
脂多糖应答米色样锚定蛋白（LRBA）缺陷导致人类严重自身免疫病和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）缺失。然而，LRBA对抗肿瘤免疫的影响仍研究不足。本文展示LRBA在抗肿瘤免疫中的重要作用，并开发靶向LRBA的小分子用于癌症免疫治疗。有趣的是，LRBA在人类患者和小鼠模型中与抗肿瘤免疫负相关。通过高通量筛选及后续先导化合物优化，我们发现小分子LC427，它通过直接结合LRBA并抑制LRBA-CTLA4相互作用，促进CTLA4的溶酶体降解并增强活化T细胞的存活。口服给予LC427增加肿瘤浸润CD8+ T细胞，并在多个小鼠肿瘤模型中显示有效抗肿瘤活性。值得注意的是，LC427不诱导免疫检查点抑制剂在结肠炎模型中观察到的免疫相关不良事件。我们的研究表明靶向LRBA提供了一种有效的癌症免疫治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LRBA是否参与抗肿瘤免疫调控，以及靶向LRBA-CTLA4相互作用能否成为兼顾疗效与安全性的癌症免疫治疗策略。
- 核心机制
- LC427直接结合LRBA的PH-BEACH结构域，抑制LRBA与细胞内CTLA4的相互作用，促进CTLA4溶酶体降解，进而增强活化CD8+ T细胞的存活、增殖与效应功能。
- 主要证据
- 患者组织芯片显示LRBA与CTLA4正相关且与CD8+ T细胞负相关；LRBA-/-小鼠肿瘤生长受抑；LC427在MC38、CT26及B16-GMCSF模型中抑制肿瘤并增加CD8+ T细胞浸润；shLrba与Ctla4+/-或abatacept实验证明LRBA/CTLA4依赖性。
- 研究意义
- 研究表明靶向LRBA的小分子LC427可作为单药或与anti-PD1联合的候选免疫治疗策略，并在小鼠模型中避免anti-CTLA4 mAb相关的免疫相关不良事件。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LRBA敲除小鼠肿瘤生长评估
直接验证LRBA对体内抗肿瘤免疫的影响。
将MC38肿瘤细胞接种于LRBA-/-与WT小鼠，测量肿瘤体积。
LRBA-CTLA4相互作用抑制剂的发现与优化
筛选并优化能特异性抑制LRBA-CTLA4相互作用的小分子。
建立Nluc互补报告系统，筛选4,501个化合物，鉴定WAY-262611（IC50 0.34 μM），进一步合成衍生物LC427（IC50 0.18 μM）并评估细胞毒性。
LC427与LRBA直接结合及结合位点验证
确认LC427直接结合LRBA并鉴定关键结合残基。
通过Co-IP、纯化蛋白结合实验、等温滴定量热法（ITC）、分子对接及LRBA PH点突变（W2314A、F2340A、R2345A、N2349A/D）验证结合与抑制作用。
LC427促进CTLA4溶酶体降解的验证
确定LC427降低CTLA4蛋白水平的降解途径。
在过表达LRBA与CTLA4的HEK293T细胞中，以时间梯度和剂量梯度处理LC427，并用氯喹（CQ）抑制溶酶体降解，结合共聚焦显微镜检测CTLA4与溶酶体共定位。
LC427对小鼠及人T细胞CTLA4表达与功能的影响
评估LC427对活化T细胞CTLA4表达、增殖、凋亡及效应功能的作用。
分离小鼠及人CD8+、CD4+ T细胞和Treg，经anti-CD3/CD28刺激后用LC427处理，流式检测表面与细胞内CTLA4、凋亡与增殖；ELISA检测IL-2与IFN-γ；OT-1 CD8+ T细胞杀伤实验评估肿瘤细胞杀伤能力。
LC427调控LRBA依赖信号通路的蛋白组学与验证
解析LC427在活化T细胞中调控的下游信号通路及其LRBA/CTLA4依赖性。
对LC427处理的活化小鼠T细胞进行TMT标记全蛋白组学与GSEA分析，并用shLrba及Ctla4-/- T细胞通过Western blot验证CTLA4、NF-κB（P50、RELA）、BCL2、CASPASE3等蛋白表达。
LC427在多种小鼠肿瘤模型中的体内抗肿瘤效果
评估LC427单药及与anti-PD1联合的体内抗肿瘤活性及对肿瘤免疫微环境的影响。
在MC38原位、MC38皮下、CT26皮下及B16-GMCSF黑色素瘤模型中口服给予LC427，监测肿瘤体积与生存；IHC与流式检测CD8+与CTLA4+ T细胞；scRNA-seq分析CD45+免疫细胞；并测试与anti-PD1联合效果。
LC427抗肿瘤效应的免疫细胞及LRBA/CTLA4依赖性验证
确认LC427的抗肿瘤作用依赖T细胞及LRBA/CTLA4通路。
在NSG免疫缺陷小鼠中测试LC427；用anti-CD4或anti-CD8 mAb清除T细胞；过继转移shLrba或shCtrl OT-1 CD8+ T细胞；使用Ctla4+/-小鼠及abatacept阻断CTLA4。
LC427体内耐受性及免疫相关不良事件评估
评估LC427在有效剂量下的毒性及是否诱发irAE。
在CT26荷瘤BALB/c小鼠中给予5、15、30 mg/kg LC427，监测体重并H&E检查心、肝、肺、脾、结肠；在3% DSS诱导结肠炎模型中比较LC427与anti-CTLA4 mAb对体重、生存、结肠病理及血清炎症因子的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Corning | -- |
| 胎牛血清 | Corning | -- | |
| 青霉素/链霉素 | GIBCO | -- | |
| T细胞扩增培养基 | Meiluncell | -- | |
| 化学筛选 | NanoBiT试剂盒 | Promega | -- |
| Nano-Glo双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| 化合物处理 | WAY-262611 | MedChemExpress | HY-11035 |
| 免疫荧光 | 溶酶体深红染料 | Thermo | L12492 |
| 玻璃底载玻片 | Cellvis | D35C4-20-0-N | |
| Co-IP | 抗Flag磁珠 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| 含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA-IP缓冲液 | Thermo Fisher | 78446 | |
| Western blot | MYC标签抗体 | ProteinTech | 16286-1-AP |
| DYKDDDDK标签抗体 | ProteinTech | 80010-1-RR | |
| 抗LRBA抗体 | Abcam | ab191174 | |
| 抗CTLA4抗体（F-8） | Santa Cruz Biotechnology | sc-376016 | |
| Bcl-2抗体 | CST | 15071 | |
| β-肌动蛋白抗体 | ProteinTech | 81115-1-RR | |
| NFκB1抗体 | ProteinTech | 14220-1-AP | |
| RELA抗体 | ProteinTech | 14220-1-AP | |
| BCL2抗体 | ProteinTech | 26593-1-AP | |
| Caspase3抗体 | ProteinTech | 19677-1-AP | |
| AP1抗体 | ProteinTech | 24909-1-AP | |
| STAT2抗体 | ProteinTech | 16674-1-AP | |
| AKT抗体 | ProteinTech | 10176-2-AP | |
| STAT5抗体 | ProteinTech | 13179-1-AP | |
| ODYSSEY CLx成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| T细胞分离 | MojoSort小鼠CD8 T细胞分离试剂盒 | BioLegend | 480008 |
| MojoSort小鼠CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒 | BioLegend | 480137 | |
| T细胞激活 | Dynabead小鼠T细胞激活剂CD3/CD28 | Life Technologies | -- |
| Dynabead人T细胞激活剂CD3/CD28 | Life Technologies | -- | |
| 流式分析 | Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | ThermoFisher | 00-5523 |
| PE Annexin V凋亡检测试剂盒1 | BD Pharmingen | -- | |
| 抗CD16/32单克隆抗体（克隆93） | Biolegend | -- | |
| BD LSRFortessa细胞分析仪 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞增殖 | eBioscience细胞增殖染料eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 65-0842-90 |
| 细胞裂解 | ACK裂解缓冲液 | Beyotime Biotechnology | C3702 |
| PBMC分离 | Ficoll分离液 | Sigma | F4375 |
| ELISA | 小鼠CXCL1/KC ELISA试剂盒 | ABclonal | RK00038 |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | ABclonal | RK00008 | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | ABclonal | RK00027 | |
| 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | ABclonal | RK00019 | |
| 组织消化 | IV型胶原酶 | Roche | -- |
| DNase I | Aladdin | -- | |
| 单细胞测序 | CD45磁珠 | Miltenyi | -- |
| Chromium单细胞5′试剂盒v2 | 10x Genomics | -- | |
| NovaSeq6000 S4试剂盒 | Illumina | -- | |
| 原位肿瘤成像 | D-荧光素 | Accela ChemBio Co., Ltd. | -- |
| Tanon ABL-X6成像系统 | Shanghai Tanon Life Science Co., Ltd. | -- | |
| 抗体治疗 | 抗CTLA4单克隆抗体（克隆9D9） | Bio X Cell | -- |
| 结肠炎造模 | 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | -- |
| 等温滴定量热 | Nano ITC微量等温滴定量热仪 | TA Instruments | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 化合物化学筛选 | 筛选化合物库来源与数量（4,501个，MCE HY-L035P）、初筛浓度20 μM、复筛浓度梯度0.01–250 μM 阅读提示：Methods“Chemical screen”小节 |
| LC427体内给药 | 给药剂量30 mg/kg、口服每日一次、给药时间窗第4–21天 阅读提示：Methods“Tumor challenge and treatment”小节及Fig. 4A图注 |
| T细胞处理与功能检测 | LC427浓度0、5、10、20 μM、处理3–5天、anti-CD3/CD28刺激条件 阅读提示：Methods“Determination of the effects of LC427 on CTLA4 expression in T cells”小节及Fig. 2F、G图注 |
| 过继转移与基因敲低 | OT-1 CD8+ T细胞过继转移数量1×10^7/小鼠、shLrba序列、E:T比1:1 阅读提示：Methods“In vivo mouse T cell-injected mouse model”“shRNA-mediated Knockdown of LRBA”及“OT-1 CD8+ T cell-mediated cytotoxicity assays”小节 |
| DSS结肠炎模型 | DSS浓度3%、饮水6–7天、anti-CTLA4 mAb 5 mg/kg腹腔注射时间点（第-3、0、3天） 阅读提示：Methods“DSS-induced colitis model and treatment”小节及Fig. 7图注 |