AKI模型中PGK1/3-PG表达验证
确认PGK1及3-PG在AKI中是否升高并与损伤相关
在I/R、顺铂、LPS诱导的AKI小鼠及AKI患者肾组织与血清中检测PGK1蛋白/mRNA、PGK1活性及3-PG水平，并进行相关性分析
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抑制PGK1通过失活PKM2/ALOX12/铁死亡通路改善雄性小鼠急性肾损伤
Inhibition of PGK1 ameliorates acute kidney injury through inactivating the PKM2/ALOX12/ferroptosis pathway in a study with male mice.
实验完整度
高含细胞模型、三种AKI小鼠模型、患者活检及条件敲除/过表达小鼠，并完成Co-IP、ChIP、功能与药物验证
主要模型
HK-2细胞 原代肾小管上皮细胞（RTECs） PGK1flox/flox与PGK1CKO小鼠I/R及顺铂AKI模型 AKI患者肾组织与血清样本
重点核对
PGK1CKO小鼠I/R模型：肾缺血30 min、再灌注24 h，每组n=6 3-PG处理：30 mg/kg腹腔注射连续2周后行I/R，每组n=6 L7DG处理：10 mg/kg腹腔注射连续3天，再行I/R，每组n=6 HK-2细胞H/R模型：缺氧12 h（5% CO2、94% N2、1% O2）后复氧2 h 顺铂模型：小鼠20 mg/kg腹腔注射，细胞20 μM处理24 h
摘要
尽管对急性肾损伤（AKI）机制的研究已持续数十年，但有效的临床治疗仍有限。本文报道，在雄性小鼠中，肾小管上皮细胞（RTECs）条件性敲除磷酸甘油酸激酶1（PGK1）可减轻AKI的发展，而特异性过表达PGK1及给予3-磷酸甘油酸（3-PG）则加重AKI。PGK1与丙酮酸激酶M2（PKM2）相互作用，诱导PKM2磷酸化，促进PKM2二聚体形成及随后的PKM2核转位。在细胞核中，PKM2与Pknox1的相互作用增强了Pknox1在ALOX12启动子区域的富集，从而导致RTECs中ALOX12介导的铁死亡。我们的药物筛选实验鉴定出L7DG作为一种潜在的PGK1抑制剂，对缺血/再灌注（I/R）诱导的肾损伤具有保护作用。总体而言，我们确立遗传学和药理学抑制PGK1可能作为管理AKI的一种途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PGK1在AKI发病机制中发挥何种作用，其下游分子机制及能否作为治疗靶点。
- 核心机制
- PGK1与PKM2结合并诱导PKM2磷酸化、二聚化及核转位，核内PKM2与Pknox1互作并增强Pknox1在ALOX12启动子的富集，上调ALOX12并诱发RTECs铁死亡。
- 主要证据
- 在I/R、顺铂、LPS诱导的小鼠模型及患者活检中PGK1与3-PG升高；RTECs特异性敲除PGK1减轻肾损伤、ROS、炎症与铁死亡，过表达PGK1或给予3-PG加重损伤；RNA测序、Co-IP MS、ChIP与双荧光素酶实验支持PGK1–PKM2–Pknox1–ALOX12轴。
- 研究意义
- 作者提出遗传学和药理学抑制PGK1可能作为管理AKI的途径，L7DG作为潜在PGK1抑制剂对I/R诱导肾损伤具有保护作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RTECs特异性PGK1敲除的功能验证
检验RTECs中PGK1缺失是否减轻AKI
构建Cdh16-Cre诱导的PGK1flox/flox条件敲除小鼠，行I/R或顺铂处理，检测肾功能、组织学损伤、ROS、凋亡、炎症及铁死亡指标
PGK1过表达与3-PG给予的加重效应
验证PGK1/3-PG轴激活是否加重AKI
采用AAV9-Ksp-cadherin启动子实现RTECs特异性PGK1过表达，或腹腔注射3-PG，行I/R或顺铂处理并检测肾损伤、ROS、炎症和铁死亡
细胞水平PGK1/3-PG功能与代谢验证
在体外确认PGK1对RTEC损伤及代谢的影响
在HK-2细胞和原代RTECs中敲低或过表达PGK1、给予3-PG，采用H/R或顺铂模型检测活力、凋亡、ROS、炎症；并行Seahorse OCR/ECAR与代谢组学
RNA测序鉴定下游铁死亡通路
筛选PGK1下游介导AKI的关键基因与通路
对PGK1CKO与对照I/R肾组织行RNA测序、差异基因与KEGG分析，并在体内外验证ALOX12、Fe2+、脂质过氧化、PTGS2等铁死亡指标
PGK1–PKM2互作及PKM2核转位机制验证
阐明PGK1调控ALOX12转录的上游分子事件
Co-IP MS筛选PGK1互作蛋白，Co-IP、GST pull-down、共聚焦、BN-PAGE及核质分离验证PGK1与PKM2结合及PKM2磷酸化、二聚化和核转位
PKM2–Pknox1–ALOX12转录轴验证
确认核内PKM2通过Pknox1促进ALOX12转录
数据库预测并筛选转录因子，ChIP检测Pknox1与ALOX12启动子结合，双荧光素酶报告及siRNA敲低验证功能
miR-3185对PGK1的负调控验证
鉴定PGK1上游miRNA调控机制
四数据库交集预测miR-3185，检测AKI患者血、I/R肾及H/R细胞中miR-3185水平，并用mimic/inhibitor和双荧光素酶验证
L7DG药物筛选与体内外验证
评估靶向PGK1的小分子对AKI的保护作用
基于ADP结合位点虚拟筛选MCE化合物库，CETSA与DARTS验证结合，细胞H/R模型及I/R小鼠验证L7DG的保护作用
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 顺铂 | -- | -- |
| 脂多糖 | Sigma–Aldrich | L2630 | |
| 细胞培养与转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 原代细胞分离 | 胶原酶 | -- | -- |
| 原代细胞培养 | 表皮生长因子 | -- | -- |
| 免疫组化 | 抗PGK1抗体 | Proteintech | 17811-1-AP |
| 肾功能检测 | 尿素氮和肌酐检测试剂盒 | Jiancheng Institute of Biotechnology | -- |
| TUNEL检测 | 一步法TUNEL凋亡检测试剂盒 | Abbkine | -- |
| Fe2+检测 | FerroOrange染料探针 | Dojindo | -- |
| 凋亡检测 | 碘化丙啶染料 | Solarbio | -- |
| ROS检测 | 二氢乙锭染料 | Beyotime | -- |
| 3-PG检测 | 3-PG酶联免疫试剂盒 | Shanghai Fantai Biotechnology Co., Ltd | -- |
| PGK1活性检测 | PGK1活性检测试剂盒 | Solarbio | BC2255 |
| 普鲁士蓝染色 | 普鲁士蓝染色试剂盒 | Solarbio | -- |
| 铁离子检测 | 铁离子检测试剂盒 | Sigma | MAK025 |
| 代谢检测 | Seahorse XF24分析仪 | Seahorse Bioscience | -- |
| 细胞线粒体压力测试试剂盒 | Seahorse Bioscience | -- | |
| 糖酵解压力测试试剂盒 | Seahorse Bioscience | -- | |
| XF实时ATP速率检测试剂盒 | Seahorse Bioscience | -- | |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| FCCP | -- | -- | |
| 鱼藤酮 | -- | -- | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | -- | -- | |
| ELISA检测 | IL-1β酶联免疫试剂盒 | BOSTER | -- |
| IL-6酶联免疫试剂盒 | BOSTER | -- | |
| TNF-α酶联免疫试剂盒 | BOSTER | -- | |
| 胱抑素C酶联免疫试剂盒 | BOSTER | -- | |
| 8-异前列腺素F2α酶联免疫试剂盒 | BOSTER | -- | |
| RT-PCR | FreeZol总RNA提取试剂 | Vazyme | -- |
| Hifair® III第一链cDNA合成预混液 | Yeasen | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Yeasen | -- | |
| Applied Biosystems QuantStudio 3实时PCR仪 | Thermo Fisher | -- | |
| 脂质过氧化检测 | Liperfluo工作液 | Dojindo | L248 |
| DAPI | Solarbio | D8200 | |
| 丙二醛检测试剂盒 | Jiancheng Institute of Biotechnology | -- | |
| Western blot | Western及IP裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Abbkine | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗β-actin抗体 | Boster | BM0627 | |
| 抗NGAL抗体 | Proteintech | 26991-1-AP | |
| 抗Bax抗体 | Proteintech | 50599-2-Ig | |
| 抗Bcl-2抗体 | Boster | A00040-2 | |
| 抗ALOX12抗体 | BOSTER | MA02275 | |
| 抗PKM2抗体 | Abcam | T2100 | |
| 抗磷酸化PKM2抗体 | Invitrogen | PA5-37684 | |
| 抗LaminB1抗体 | Proteintech | 12987-1-AP | |
| 抗IL-1β抗体 | Proteintech | 16806-1-AP | |
| 抗cleaved-caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 抗兔IgG二抗 | Proteintech | SA00001-2 | |
| 抗小鼠IgG二抗 | Proteintech | SA00001-1 | |
| 增强化学发光液 | Bio-sharp | -- | |
| 免疫荧光 | 抗F4/80抗体 | Proteintech | 29414-1-AP |
| 抗Nox2抗体 | Proteintech | 19013-1-AP | |
| 抗Pknox1抗体 | Proteintech | 10614-1-AP | |
| Triton X-100 | Beyotime Biotechnology | P0096 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8溶液 | Biosharp | BS350A |
| Synergy H4酶标仪 | BioTek | -- | |
| 核质分离 | 核质蛋白提取试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| GPX4活性检测 | GPX4活性检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K883-M |
| RNA测序 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| Novaseq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| DARTS | 链霉蛋白酶E | Macklin | P861439 |
| Co-IP MS | 蛋白A/G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY-nLC 1200超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Orbitrap Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Co-IP | 蛋白A/G磁珠 | MedChemExpress | -- |
| 双荧光素酶报告 | pGL3荧光素酶载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告检测系统 | Promega | -- | |
| ChIP | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Abcam | Ab185913 |
| 代谢组学 | Vanquish超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Orbitrap Q Exactive™ HF或HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Hypersil GOLD色谱柱 | Waters | -- | |
| 药物筛选 | 木犀草素-7-二葡萄糖醛酸苷 | -- | -- |
| CBR-470-1 | -- | -- | |
| 铁死亡抑制验证 | Liproxstatin-1 | -- | -- |
| Ferrostatin-1 | -- | -- | |
| 去铁胺 | -- | -- | |
| 铁死亡诱导验证 | 枸橼酸铁铵 | -- | -- |
| ALOX12抑制验证 | ML355 | -- | -- |
| 铁死亡/ROS验证 | N-乙酰半胱氨酸 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| I/R诱导AKI小鼠模型 | 肾蒂夹闭时间30 min、再灌注24 h、8周龄C57BL/6J背景、麻醉与取材流程 阅读提示：Methods Animals及Fig. 1、Fig. 2图注 |
| 顺铂/LPS诱导AKI小鼠模型 | 顺铂20 mg/kg腹腔注射后3天取材；LPS 10 mg/kg腹腔注射后24 h取材 阅读提示：Methods Animals及Fig. 1图注 |
| RTECs特异性PGK1敲除 | PGK1flox/flox与Cdh16-CreERT2品系、他莫昔芬诱导方案（文中未明确说明剂量与时长）、敲除效率约80% 阅读提示：Methods Animals及Supplementary Fig. S5 |
| RTECs特异性PGK1过表达 | rAAV9-Ksp-cadherin-PGK1剂量1×10^10病毒颗粒/鼠、6周龄注射、6周后行I/R 阅读提示：Methods Animals及Supplementary Fig. S10、S11 |
| 3-PG处理 | 3-PG 30 mg/kg腹腔注射连续2周后行I/R或顺铂处理 阅读提示：Methods Animals及Fig. 3图注、Supplementary Fig. S15 |
| L7DG处理 | L7DG 10 mg/kg腹腔注射连续3天；细胞10 μM预处理24 h 阅读提示：Methods Animals、Cell culture及Fig. 7图注 |
| HK-2细胞H/R与顺铂模型 | 缺氧12 h（5% CO2、94% N2、1% O2）后复氧2 h；顺铂20 μM处理24 h；转染48 h 阅读提示：Methods Cell culture, hypoxia/reoxygenation (H/R) model, cisplatin model, and transfection |
| Co-IP MS与转录轴验证 | 正常小鼠肾组织n=2、抗PGK1抗体、protein A/G磁珠；ChIP使用Pknox1抗体与ALOX12启动子引物；双荧光素酶报告构建范围 阅读提示：Methods Detection of LC-MS/MS、Co-immunoprecipitation、ChIP assay、Luciferase reporter assay |
| 统计设计与样本量 | 体内实验每组n=6，蛋白/mRNA每组n=4–6，RNA测序n=3，患者血清3-PG每组n=30；ANOVA/Bonferroni或t检验 阅读提示：Methods Statistical analysis及各图注 |