患者样本中ATG7表达分析
验证NTM-PD患者中ATG7表达是否改变及其与炎症因子的关系。
分析既往nCounter数据（GSE290289），用qRT-PCR检测PBMCs中ATG7 mRNA，用免疫组化检测肺组织坏死与非坏死区域ATG7表达。
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固有免疫细胞中的ATG7是宿主防御非结核分枝杆菌肺部感染所必需的
ATG7 in innate immune cells is required for host defense against nontuberculous mycobacterial pulmonary infections.
实验完整度
高含患者PBMC与肺组织样本、Atg7 cKO小鼠模型、体外BMDM与hMDM，并行空间/单细胞转录组及功能验证
主要模型
非结核分枝杆菌肺病患者外周血单个核细胞与肺组织样本 固有免疫细胞特异性Atg7敲除（Atg7 fl/flLysM-Cre+/+）小鼠 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） 人原代单核细胞来源巨噬细胞（hMDMs）
重点核对
小鼠基因型：Atg7 fl/flLysM-Cre+/+与Atg7 fl/fl（cWT）对照，8–10周龄，性别与年龄匹配 气道感染剂量与菌株：Mabc-S 1×10^6或1×10^7 CFU/鼠、Mabc-R 2×10^6 CFU/鼠、Mav 1×10^6或1×10^7 CFU/鼠、Mint 1×10^7 CFU/鼠、Mmass 1×10^7 CFU/鼠 体外感染复数与时间：BMDMs感染Mabc-S/Mabc-R MOI 5（6 h或18 h），Mabc-R MOI 1或3（CFU），Mabc-S MOI 1或5（CFU）；hMDMs感染Mabc-R/Mabc-S/Mav MOI 3或5 中性粒细胞清除方案：anti-Ly6G mAb（clone 1A8）0.5 mg/鼠腹腔注射，每1或2天一次；同型对照anti-IgG2a（clone 2A3） 检测终点：肺组织细菌载量（CFU）、炎症面积（H&E）、细胞因子（ELISA）、GSDME/GSDMD剪接（Western blot）、Ly6G+中性粒细胞（流式）
摘要
由非结核分枝杆菌（如鸟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌）引起的感染日益普遍，不断上升的抗生素耐药性构成了重大的临床挑战。然而，宿主防御系统控制这些感染的机制仍知之甚少。本研究表明，固有免疫细胞中的自噬相关蛋白ATG7在控制非结核分枝杆菌感染和保护肺组织免受病理性炎症方面发挥重要作用。非结核分枝杆菌肺病患者的外周血单个核细胞中ATG7表达降低，病变部位的坏死病灶中ATG7水平下降。固有免疫细胞中缺失Atg7的小鼠表现出细菌载量升高、过度炎症、线粒体损伤以及肺部多种形式的细胞死亡，包括焦亡、坏死和凋亡。值得注意的是，这些小鼠肺部的中性粒细胞浸润在驱动加剧的炎症和gasdermin E相关的细胞死亡中起关键作用，且这些事件先于细菌过度生长。体外实验中，Atg7缺陷的巨噬细胞表现出抗菌反应受损和吞噬溶酶体融合减少，但炎症和细胞死亡仅轻度增加。这些发现强调了固有免疫细胞中的ATG7通过减轻中性粒细胞驱动的病理性炎症及相关细胞死亡，在协调有效的宿主防御对抗非结核分枝杆菌肺部感染中的关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 固有免疫细胞中的ATG7在宿主防御非结核分枝杆菌肺部感染中是否必需，以及其通过何种机制发挥作用。
- 核心机制
- ATG7在固有免疫细胞中限制过度中性粒细胞浸润及其驱动的病理性炎症和GSDME相关的焦亡性细胞死亡，从而控制细菌过度生长；体外ATG7还促进LC3+自噬体形成和吞噬溶酶体融合以限制胞内分枝杆菌存活。
- 主要证据
- 患者PBMC和肺坏死病灶中ATG7表达降低；Atg7 cKO小鼠感染多种NTM后肺细菌载量升高、炎症和中性粒细胞浸润加剧、线粒体损伤和多种细胞死亡增加；抗Ly6G清除中性粒细胞可降低Atg7 cKO小鼠细菌载量、炎症因子和GSDME剪切；体外Atg7缺陷BMDMs和ATG7敲低hMDMs胞内细菌存活增加、吞噬溶酶体融合减少。
- 研究意义
- 揭示ATG7在固有免疫细胞中协调有效宿主防御NTM肺部感染的作用，为理解NTM-PD宿主-病原互作机制及疫苗和治疗策略提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Atg7 cKO小鼠模型构建与NTM体内感染
验证固有免疫细胞中Atg7缺失对NTM肺部感染细菌载量和病理的影响。
将Atg7 fl/fl与LysM-Cre小鼠杂交获得Atg7 cKO，经鼻感染Mabc-S、Mabc-R、Mav、Mint或Mmass，检测肺组织细菌载量、荧光成像和H&E炎症面积。
空间转录组与单细胞转录组分析
鉴定Atg7 cKO肺组织中炎症、氧化应激和细胞死亡通路的空间及细胞类型分布。
对Mav感染21天的小鼠肺FFPE组织进行10× Genomics Visium空间转录组，对肺细胞进行10X Genomics scRNA测序，分析通路模块评分和细胞类型。
氧化应激、线粒体损伤和细胞死亡检测
验证Atg7 cKO肺组织中氧化应激、线粒体损伤及多种细胞死亡通路是否加剧。
用MitoSOX和DHE染色检测mtROS和总ROS，TEM观察线粒体形态，PI染色和免疫印迹检测细胞死亡及GSDMD/GSDME剪切。
中性粒细胞清除实验
验证中性粒细胞在Atg7 cKO小鼠NTM感染中驱动炎症和细胞死亡的作用。
感染Mabc-S后给予anti-Ly6G或同型对照抗体，检测肺细菌载量、IL-6、TNF和GSDME剪切。
体外巨噬细胞感染与功能检测
验证ATG7对巨噬细胞抗菌反应、自噬体形成、吞噬溶酶体融合及炎症的影响。
用GFP标记Mabc感染BMDMs，共聚焦显微镜检测LC3和LAMP1共定位，TEM观察自噬体，CFU法检测胞内细菌存活，ELISA检测细胞因子；用shRNA敲低hMDMs中ATG7后感染Mabc或Mav。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液 | axis-sheid | 1114545 |
| RPMI 1640培养基 | Corning | 10-040-CV | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Sigma Aldrich | M6518 | |
| DMEM培养基 | Corning | 10-013-CVRC | |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000-044 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240062 | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | R&D Systems | 416-ML-010 | |
| 分枝杆菌培养 | 7H10琼脂 | Difco | 262710 |
| 油酸白蛋白右旋糖过氧化氢酶 | BD Bioscience | 212240 | |
| 混合研磨仪 | Retsch | -- | |
| Western blot | 抗IL-1β抗体 | Cell Signaling Technology | 12242 |
| 抗Caspase-1抗体 | Cell Signaling Technology | 2225 | |
| 抗Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| 抗剪切型Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 抗GSDMD抗体 | Cell Signaling Technology | 39754 | |
| 抗ATG7抗体 | Cell Signaling Technology | 8558 | |
| 抗ACTB抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 抗小鼠IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 抗兔IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 抗DFNA5/GSDME N端抗体 | Abcam | ab2159 | |
| 免疫荧光 | 抗LC3A/B抗体 | MBL International | PM036 |
| 抗LAMP1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-19992 | |
| Alexa Fluor 405标记抗大鼠IgG | Invitrogen | A48261 | |
| Alexa Fluor 488标记抗兔IgG | Invitrogen | A17041 | |
| Alexa Fluor 594标记抗兔IgG | Invitrogen | A21207 | |
| 细胞刺激 | Pam3CSK4 | Invitrogen | tlrl-pms |
| ROS检测 | 二氢乙锭 | Invitrogen | D11347 |
| 线粒体染色 | MitoTracker深红FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 |
| 蛋白裂解 | RIPA裂解液 | LPS solution | CBR002 |
| Western blot | 1×封闭液 | Biofact | OP105-500 |
| 蛋白裂解 | 蛋白酶抑制剂 | Roche | 4693116001 |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | 4906837001 | |
| 免疫荧光 | 髓过氧化物酶抗体 | R&D System | AF3667 |
| 抗瓜氨酸化组蛋白H3抗体 | Novus Biologicals | NB100-57135 | |
| 中性粒细胞清除 | InVivoMAb小鼠IgG2a同型对照 | BioXCell | BE0085 |
| InVivoMAb抗小鼠Ly6G抗体 | BioXCell | BE0075-1 | |
| 流式细胞术 | Alexa Fluor 700大鼠抗小鼠CD45抗体 | Invitrogen | 56-0451-82 |
| PE-Cyanine7大鼠抗Ly6G抗体 | Invitrogen | 25-9668-82 | |
| Zombie Violet可固定活力检测试剂盒 | BioLegend | 423114 | |
| APC抗小鼠CD64抗体 | BioLegend | 161006 | |
| PE抗小鼠MERTK抗体 | BioLegend | 151506 | |
| APC-Cy7大鼠抗CD11b抗体 | BD Biosciences | 557657 | |
| Annexin V-PI染色试剂盒 | BD Biosciences | 556547 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| cDNA合成 | 逆转录酶预混液 | ELPIS-BIOTECH | EBT 1515C |
| qRT-PCR | SYBR Green预混液 | Qiagen | 208056 |
| Rotor-Gene Q 2plex系统 | Qiagen | -- | |
| 慢病毒包装 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L300015 |
| ATG7 shRNA质粒 | Santa Cruz Biotechnology | sc-41447-SH | |
| pRSV-Rev质粒 | Addgene | 12253 | |
| pMDLg/pRRE质粒 | Addgene | 12251 | |
| pMD2.G质粒 | Addgene | 12259 | |
| 免疫组化 | ATG7抗体 | Abcam | ab54272 |
| 组织切片扫描 | PANNORAMIC 300 Flash DX扫描仪 | 3DHISTECH Ltd | -- |
| 免疫荧光 | 碘化丙啶 | Thermo Fisher Scientific | P3566 |
| 含DAPI的Prolong Gold抗淬灭封片剂 | Invitrogen | P36931 | |
| ELISA | 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7013-22 |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | BD Bioscience | 555240 | |
| 小鼠TNF ELISA试剂盒 | BD Bioscience | 560478 | |
| 人IL-1β ELISA试剂盒 | BD Bioscience | 557953 | |
| 人IL-6 ELISA试剂盒 | BD Bioscience | 555220 | |
| Western blot | Immobilon Western化学发光HRP底物 | Merck | WBKLS0500 |
| iBright成像系统 | Invitrogen | CL750 | |
| 空间转录组 | RNeasy FFPE试剂盒 | Qiagen | 73504 |
| Visium FFPE空间基因表达试剂盒小鼠转录组v.1 | 10x Genomics | PN-1000521 | |
| 双索引试剂盒TS Set A | 10x Genomics | PN-1000251 | |
| scRNA测序 | Liberase TL酶 | Roche | 05401020001 |
| LUNA-FX7自动细胞计数仪 | Logos Biosystems | -- | |
| Chromium Next GEM单细胞3’试剂盒v3.1 | 10x Genomics | PN: 1000268 | |
| Chromium Next GEM Chip G单细胞试剂盒 | 10x Genomics | PN: 1000120 | |
| 双索引试剂盒TT Set A | 10x Genomics | PN: 1000215 | |
| NovaSeq 5000/6000 S2试剂盒（200循环）v1.5 | Illumina | PN: 20028315 | |
| 透射电镜 | JEM-1400Plus透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| JEM-1000BEF透射电子显微镜 | JEOL | -- | |
| 流式细胞术 | 小鼠肺组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotech | 130-095-927 |
| BD FACSDiscover S8细胞分选仪 | BD Biosciences | NFEC-2025-02-303724 | |
| 共聚焦显微镜 | TCS SP8共聚焦激光显微镜 | Leica | -- |
| mtROS检测 | MitoSOX红色线粒体超氧化物指示剂 | Invitrogen | M36007 |
| 共聚焦显微镜 | LSM900共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 光学成像 | Night OWL LB983光学成像系统 | Berthold Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠基因型与感染模型 | Atg7 cKO（Atg7 fl/flLysM-Cre+/+）与对照Atg7 cWT（Atg7 fl/fl）的构建策略、小鼠周龄（8–10周）、性别匹配、经鼻感染菌株及CFU剂量、感染时长 阅读提示：Methods中Mice和Mouse in vivo infection model小节；Fig. 1d–f图注 |
| 患者样本分析 | PBMC队列的疾病分组和样本量（Mabc n=31，Mmass n=22，HC n=39），肺组织免疫组化样本量（n=12），坏死与非坏死区域定义 阅读提示：Methods中Patients and clinical samples、Data analysis of the human PBMC samples小节；Fig. 1a–c图注 |
| 体外巨噬细胞感染 | BMDMs分化条件（M-CSF 5天）、感染MOI（Mabc-S/Mabc-R MOI 5，CFU实验MOI 1–5）、感染时间（6、18、72、96小时），hMDMs的shRNA转导MOI 10和36小时 阅读提示：Methods中Cells、Lentiviral shRNA production and transduction小节；Fig. 8–10图注 |
| 中性粒细胞清除 | 抗体克隆号（anti-Ly6G clone 1A8，同型对照clone 2A3）、剂量0.5 mg/鼠、腹腔注射频率（每1或2天）、感染菌株和CFU（Mabc-S 1×10^7 CFU/鼠）、清除时长（7天） 阅读提示：Methods中Neutrophil depletion小节；Fig. 7e–h图注 |
| 空间转录组与scRNA测序 | 测序平台（10× Genomics Visium和Chromium）、感染条件（Mav 1×10^7 CFU/鼠，21天）、每组小鼠数量（每组1只）、数据分析软件和参数 阅读提示：Methods中Tissue processing and spatial transcriptomic generation、scRNA sequencing and data analysis小节；Fig. 2a、Fig. 6a图注 |