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        靶向BCL-XL的BH3模拟物在RB1缺失且存在复制应激的实体瘤中具有疗效

        BH3 mimetics targeting BCL-XL have efficacy in solid tumors with RB1 loss and replication stress.

        作者信息Andreas Varkaris, Keshan Wang, Mannan Nouri, Nina Kozlova, Daniel R Schmidt, Anastasia Stavridi, Seiji Arai, Nicholas Ambrosio, Larysa Poluben, Juan M Jimenez-Vacas, Daniel Westaby, Juliet Carmichael, Fang Xie, Ines Figueiredo, Lorenzo Buroni, Antje Neeb, Bora Gurel, Nicholas Chevalier, Lisha Brown, Olga Voznesensky, Shao-Yong Chen, Joshua W Russo, Xin Yuan, Dejan Juric, Himisha Beltran, Johann S De Bono, Matthew G Vander Heiden, David J Einstein, Taru Muranen, Eva Corey, Adam Sharp, Steven P Balk
        PMID40436896
        期刊Nat Commun
        发布时间2025-05-28
        DOI10.1038/s41467-025-60238-x
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含患者来源3D类器官、多种细胞系、异种移植瘤模型及体内药物联合验证，并有siRNA/免疫印迹机制验证。

        主要模型

        前列腺癌患者来源异种移植（PDX）来源的3D球体及类器官（BIDPC1、BIDPC5等） 前列腺癌细胞系LNCaP LNCaP和ZR75皮下异种移植瘤小鼠模型

        重点核对

        BIDPC1和BIDPC5 PDX来源3D球体经navitoclax处理4天后的细胞回收率及IC50值（BIDPC5为100 nM，BIDPC1为125 nM） LNCaP细胞经RB1 siRNA或shRNA敲低后navitoclax诱导的caspase活性和凋亡标志物（cleaved PARP、cleaved caspase 3） LNCaP异种移植瘤随机分组后raltitrexed（50 mg/kg q4天）和navitoclax（50 mg/kg q2天）联合治疗的肿瘤体积变化及生存期 ZR75异种移植瘤随机分组后capecitabine（200 mg/kg每日）和navitoclax（50 mg/kg q2天）联合治疗的肿瘤体积变化及生存期 TCGA前列腺癌数据库RB1拷贝数与ATR复制应激反应基因集富集分析

        摘要

        抑制BCL-2、BCL-XL或MCL-1的BH3模拟药物在实体瘤中活性有限。通过对异种移植来源的3D前列腺癌模型和细胞系进行评估，我们发现RB1缺失的肿瘤对BCL-XL抑制敏感。同时，药物筛选表明，包括胸苷酸合成酶抑制剂在内的药物破坏核苷酸池可致敏于BCL-XL抑制，共同提示复制应激增加对BCL-XL的依赖。机制上，我们证实复制应激通过TP53/CDKN1A依赖的BIRC5表达抑制致敏于BCL-XL抑制。在 prostate 和 breast cancer 异种移植模型中，BCL-2/BCL-XL抑制剂（navitoclax）与胸苷酸合成酶抑制剂（raltitrexed或capecitabine）联合治疗引起显著且持久的肿瘤消退。这些发现表明，BCL-XL抑制剂可能在具有RB1缺失的实体瘤亚群中作为单药有效，并且药理学诱导复制应激可能是增敏BCL-XL抑制剂的广泛适用方法。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        BH3模拟物在实体瘤中活性有限，本研究试图确定哪些实体瘤亚群对BCL-XL抑制敏感，以及复制应激是否及如何增加对BCL-XL的依赖。
        核心机制
        RB1缺失导致复制应激，复制应激通过TP53/CDKN1A依赖的机制抑制BIRC5/Survivin表达，从而增加对BCL-XL的依赖并致敏于BCL-XL抑制；在TP53缺陷的T47D细胞中，胸苷酸合成酶抑制还可通过整合应激反应下调MCL-1。
        主要证据
        前列腺癌PDX来源3D球体和类器官中RB1缺失与navitoclax敏感性相关；RB1 siRNA/shRNA在LNCaP细胞中增加navitoclax诱导的凋亡；药物筛选和DNA纤维实验证实胸苷酸合成酶抑制剂诱导复制应激；siRNA敲低TP53或CDKN1A阻断5-FU对Survivin的下调；LNCaP和ZR75异种移植瘤中navitoclax联合raltitrexed或capecitabine引起肿瘤消退和生存期延长。
        研究意义
        作者提出BCL-XL抑制剂可能在具有RB1缺失的实体瘤亚群中作为单药有效，并且药理学诱导复制应激可能是增敏BCL-XL抑制剂的广泛适用方法，支持capecitabine或相关药物与BCL-XL抑制剂联合用于实体瘤的临床试验。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        前列腺癌模型对BH3模拟物的敏感性筛选

        确定哪些前列腺癌模型对BCL-XL、BCL-2或MCL-1抑制敏感。

        在PDX来源2D/3D培养、患者来源类器官和细胞系中，用navitoclax、venetoclax或S63845进行剂量范围处理，评估细胞回收率和IC50。

        2

        RB1缺失与BCL-XL依赖性的关联验证

        验证RB1缺失是否增加对BCL-XL的依赖。

        对RB1缺失和RB1完整PDX来源类器官进行navitoclax处理，检测caspase活性和细胞活力；在LNCaP细胞中用siRNA或shRNA敲低RB1，检测navitoclax诱导的凋亡；利用GDSC数据库分析RB1改变与BCL-XL抑制剂IC50的关系。

        3

        小分子药物筛选鉴定navitoclax增敏剂

        筛选可增敏前列腺癌细胞对navitoclax响应的小分子药物。

        LNCaP细胞在navitoclax或DMSO存在下培养2天，加入ICCB-Longwood Mechanism of Action文库（约1245种药物，4个浓度，双复孔）处理2天，Cell Titer-Glo评估细胞活力。

        4

        胸苷酸合成酶抑制剂诱导复制应激和DNA损伤的验证

        确认胸苷酸合成酶抑制剂通过破坏脱氧核苷酸池引起复制应激和DNA损伤反应。

        LNCaP细胞用nolatrexed或raltitrexed处理，通过DNA纤维实验检测复制叉速度，通过COMET实验检测DNA损伤，通过免疫印迹检测RPA32和H2A.X磷酸化，并通过胸苷补充验证特异性。

        5

        复制应激增敏BCL-XL抑制的细胞凋亡验证

        验证胸苷酸合成酶抑制剂或其他复制应激诱导剂是否增敏BCL-XL抑制诱导的凋亡。

        LNCaP及多种细胞系（ZR75、A549、A375P、RKO）用nolatrexed、raltitrexed、5-FU或BML-277处理，随后加入navitoclax、AZD4320、PZ18753B或DT2216，检测caspase 3/7活性和凋亡标志物。

        6

        BIRC5/Survivin下调机制的解析

        确定复制应激增敏BCL-XL抑制是否由Survivin下调介导，并验证TP53/CDKN1A依赖性。

        用siRNA敲低BAX、BAK、PUMA、BIRC5、TP53或CDKN1A，检测nolatrexed+navitoclax诱导的凋亡；用YM-155或nutlin-3a下调Survivin或激活p53，检测对navitoclax和AZD4320的增敏；免疫印迹检测p53、p21、Survivin、MCL-1等蛋白。

        7

        体内联合治疗效果评估

        评估BCL-XL抑制剂与胸苷酸合成酶抑制剂联合在体内的疗效。

        在免疫缺陷小鼠中建立LNCaP和ZR75皮下异种移植瘤，随机分组给予vehicle、raltitrexed、navitoclax或联合治疗，监测肿瘤体积和生存期，并通过免疫印迹检测肿瘤凋亡标志物和Survivin表达。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        免疫组织化学STR图谱分析支原体检测
        验证细胞功能变化
        Cell Titer-Glo细胞活力检测Caspase-Glo 3/7凋亡检测荧光法caspase 3/7活性检测发光法caspase 3/7活性检测
        验证分子表达变化
        免疫印迹siRNA敲低shRNA敲低
        验证机制链路
        DNA纤维实验彗星实验（单细胞电泳）单样本基因集富集分析
        评估体内效果
        异种移植瘤模型Kaplan-Meier生存分析肿瘤体积测量
        数据分析与统计
        单因素方差分析双因素方差分析非配对t检验Wilcoxon秩和检验对数秩检验
        药物筛选
        作用机制药物文库筛选

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基CorningMT10040CV
        胎牛血清GibcoA3160401
        支原体检测MycoAlert支原体检测试剂盒LonzaLT07-218
        细胞活力检测Cell Titer-Glo 3D细胞活力检测试剂盒Promega--
        Cell Titer-Glo细胞活力检测试剂盒Promega--
        免疫印迹RIPA裂解液Fisher ScientificPI89900
        蛋白酶抑制剂Fisher ScientificPI78437
        磷酸酶抑制剂混合物Fisher ScientificPI78426
        抗RPA32/RPA2（磷酸化S33）抗体Abcamab211877
        抗H2A.X磷酸化Ser139抗体（克隆20E3）Cell Signaling Technology9718
        抗p53抗体Cell Signaling Technology9282
        抗p21抗体（克隆EPR3993）Abcamab109199
        抗Survivin抗体Cell Signaling Technology2808
        抗RB1抗体（克隆4H1）Cell Signaling Technology9309
        抗Bad抗体Cell Signaling Technology9239
        抗BAK抗体Cell Signaling Technology12105
        抗BAX抗体Cell Signaling Technology5023
        抗β-actin抗体Abcamab6276
        抗BCL2抗体Cell Signaling Technology4223
        抗BCL-XL抗体Cell Signaling Technology2764
        抗BIM抗体Cell Signaling Technology2933
        抗cleaved caspase 3抗体Cell Signaling Technology9664
        抗MARCH5抗体EMD Millipore06-1036
        抗MCL1抗体Cell Signaling Technology5453
        抗NOXA抗体Abcamab13654
        抗PARP抗体Cell Signaling Technology9532
        抗磷酸化eIF2α Ser51抗体Cell Signaling Technology9721
        抗PUMA抗体Cell Signaling Technology12450
        抗vinculin抗体Santa Cruz Biotechnologysc-73614
        抗兔二抗PromegaW401B
        抗小鼠二抗PromegaW402B
        彗星实验彗星实验高通量试剂盒Trevigen, R&D4252-040-K
        SyBr Gold核酸染料Thermo FisherS11494
        DNA纤维实验CIdUSigmaC6891
        IdUSigma17125
        抗CIdU抗体Abcamab6326
        抗IdU抗体BD347580
        siRNA转染SignalSilence Survivin siRNA IICell Signaling Technologies6546
        靶向RB1的siRNAHorizon Discovery Biosciences Ltd/DharmaconL-003296-02-0005
        靶向BAK的siRNAHorizon Discovery Biosciences Ltd/DharmaconL-003305-00-0005
        靶向BAX的siRNAHorizon Discovery Biosciences Ltd/DharmaconL-003308-01-0005
        靶向PUMA的siRNAHorizon Discovery Biosciences Ltd/DharmaconL-004380-00-0005
        靶向TP53的siRNAHorizon Discovery Biosciences Ltd/DharmaconE-003329-00-0005
        靶向CDKN1A的siRNAHorizon Discovery Biosciences Ltd/DharmaconL003471-00-0005
        类器官培养Accumax细胞解离液ThermoFisher--
        基质胶（生长因子减少型）----

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        BH3模拟物敏感性筛选
        细胞模型来源及代数、navitoclax/venetoclax/S63845浓度范围、处理时间（4天）、技术重复和生物学重复数
        阅读提示：Methods中PCa in vitro models和Cell lines and RNAi小节；Fig. 1a和Fig. 1b图注
        RB1缺失与BCL-XL敏感性验证
        RB1缺失PDX模型鉴定（IHC H-score）、navitoclax处理浓度和时间、siRNA/shRNA敲低效率验证
        阅读提示：Results中Tumors with loss of RB1 activity have increased dependency on BCL-XL小节；Fig. 2图注；Supplementary Fig. S1b
        药物增敏筛选
        ICCB-L MoA文库版本（1245化合物）、navitoclax浓度（500 nM）、化合物浓度数（4个）、筛选终点（Cell Titer-Glo）及z-score阈值
        阅读提示：Methods中Mechanism of Action library drug screening小节；Fig. 3a图注
        复制应激和DNA损伤检测
        胸苷酸合成酶抑制剂浓度（nolatrexed 2或4 μM，raltitrexed 1 μM）、处理时间（16-48小时）、DNA纤维实验脉冲标记浓度和时间、COMET实验电泳条件
        阅读提示：Methods中Comet assay和DNA fiber spreading小节；Fig. 4b和Supplementary Fig. S5
        体内联合治疗实验
        小鼠品系和周龄、肿瘤接种细胞数、随机化时肿瘤体积、药物剂量和给药频率（raltitrexed 50 mg/kg q4天，navitoclax 50 mg/kg q2天，capecitabine 200 mg/kg每日）、给药途径和持续时间、每组动物数
        阅读提示：Methods中Animal models小节；Fig. 7a和Fig. 7g图注
        Survivin下调机制验证
        siRNA敲低TP53或CDKN1A的效率、5-FU处理浓度和时间、免疫印迹抗体稀释比例、DREAM复合体相关验证条件
        阅读提示：Results中Decreased Survivin is dependent on p53 activation小节；Fig. 6图注

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