外源NO对EZH2及H3K27me3的调控检测
验证NO供体是否影响EZH2蛋白水平及其催化产物H3K27me3。
用SNP处理EA.hy926细胞及大鼠主动脉环，免疫印迹检测EZH2与H3K27me3随时间变化；Griess assay检测亚硝酸盐；qPCR检测EZH2 mRNA。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
EZH2的S-亚硝基化改变PRC2组装、甲基转移酶活性及EZH2稳定性以维持内皮稳态
S-nitrosylation of EZH2 alters PRC2 assembly, methyltransferase activity, and EZH2 stability to maintain endothelial homeostasis.
实验完整度
高涵盖细胞系、大鼠主动脉离体、糖尿病大鼠在体模型，并含点突变、biotin switch、分子动力学等功能与机制验证
主要模型
EA.hy926内皮细胞 HUVEC HEK-293细胞 雄性Wistar大鼠主动脉环离体培养 链脲佐菌素诱导的糖尿病SD大鼠肾脏模型
重点核对
SNP 500 μM、GSNO 100 μM处理时间点（0、0.5、1、2、4 h）下的EZH2与H3K27me3水平 EZH2 C329S、C700S及C329S C700S突变体在HEK-293/EA.hy926中的S-亚硝基化、稳定性、定位与H3K27me3检测 EZH2抗体免疫共沉淀检测SUZ12等PRC2亚基在0.5 h时的结合变化 MG132（1 μM）与bafilomycin A1（100 nM）对SNP/GSNO诱导EZH2降解的逆转实验 间歇性高糖（25 mM/5.5 mM循环3次共72 h）联合GSNO处理下EZH2、H3K27me3、ICAM1及单核细胞黏附检测
摘要
一氧化氮（NO）是一种多功能的生物活性分子，通过包括蛋白质S-亚硝基化在内的多种机制调节细胞功能。本文报道，在内皮细胞中EZH2的特定半胱氨酸残基发生S-亚硝基化，并与其稳定性和功能相互作用。我们检测到EZH2发生S-亚硝基化后H3K27me3显著减少，这是由SUZ12从PRC2中早期解离所导致的。此外，EZH2的S-亚硝基化导致其向胞质转位、泛素化及降解。进一步分析显示，半胱氨酸329的S-亚硝基化诱导EZH2不稳定，而半胱氨酸700的S-亚硝基化则消除其催化活性。我们还进一步表明，S-亚硝基化依赖性的EZH2调控在生理和病理状态下均维持内皮稳态。分子动力学模拟揭示，S-亚硝基化后SUZ12无法有效结合EZH2的SAL结构域。总之，本研究报道了S-亚硝基化依赖性的EZH2及其相关PRC2复合体的调控，从而影响内皮稳态的表观遗传学。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NO介导的组蛋白甲基转移酶EZH2的翻译后修饰是否影响其催化活性、亚细胞定位和稳定性，从而调控内皮稳态？
- 核心机制
- NO通过S-亚硝基化EZH2的C329和C700残基，促使SUZ12从PRC2复合体早期解离、降低H3K27me3沉积，并诱导EZH2向胞质转位、泛素化及主要经自噬体-溶酶体途径降解；其中C329的S-亚硝基化介导EZH2不稳定与转位，C700的S-亚硝基化介导催化活性丧失。
- 主要证据
- 在EA.hy926、HUVEC及大鼠主动脉环中，SNP/GSNO/bradykinin/VEGF处理引起EZH2 S-亚硝基化、SUZ12早期解离、H3K27me3下降、EZH2胞质转位与降解；点突变实验显示C329S/C700S及双突变体对NO反应改变；GSNO在间歇性高糖模型中逆转EZH2/H3K27me3升高、ICAM1表达及单核细胞黏附；分子动力学模拟显示S-亚硝基化削弱SUZ12与EZH2 SAL结构域结合。
- 研究意义
- 研究揭示NO通过S-亚硝基化直接调控表观遗传修饰因子EZH2及PRC2复合体，将eNOS依赖的NO释放与染色质结构和内皮基因表达变化相联系，并提示S-亚硝基化调控EZH2可能作为应对糖尿病血管并发症的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
内源性NO产生机制的验证
验证内皮eNOS来源的NO是否同样调控EZH2与H3K27me3。
用bradykinin或VEGF诱导HUVEC/EA.hy926及大鼠主动脉环，检测EZH2与H3K27me3；用eNOS siRNA或L-NAME阻断。
PRC2组装与EZH2亚细胞定位分析
确定NO是否影响EZH2与PRC2亚基结合及其核质分布。
EZH2抗体免疫共沉淀检测SUZ12、EED、AEBP2、JARID2结合；亚细胞分离与免疫荧光共聚焦检测EZH2定位及与F-actin共定位。
EZH2 S-亚硝基化的直接检测
确认NO处理使EZH2发生S-亚硝基化。
biotin switch assay、iodoTMT标记、Nitro-Cysteine抗体免疫沉淀-免疫印迹检测EZH2 S-亚硝基化。
EZH2降解途径分析
确定S-亚硝基化EZH2的降解机制。
检测EZH2泛素化；用MG132、bafilomycin A1及二者联合处理，免疫印迹检测EZH2与H3K27me3。
关键半胱氨酸位点的功能解析
确定EZH2中负责S-亚硝基化的关键半胱氨酸及其功能分工。
GPS-SNO预测C260、C329、C700；定点突变构建C260S、C329S、C700S及C329S C700S；在HEK-293/EA.hy926中检测S-亚硝基化、EZH2稳定性、H3K27me3、定位及SUZ12结合。
内皮功能与基因表达的下游验证
验证EZH2-H3K27me3轴在NO依赖的内皮基因表达和迁移中的作用。
GSK-J4抑制JMJD3/UTX，划痕实验检测迁移；RT-qPCR检测VEGFa、TBX20、MMP2、FGF2、Angiopoietin-2等；ChIP-qPCR检测启动子H3K27me3富集。
病理模型中的验证
验证S-亚硝基化EZH2在糖尿病相关内皮损伤中的作用。
间歇性高糖处理HUVEC及大鼠主动脉环，联合GSNO，检测EZH2、H3K27me3、ICAM1及THP-1单核细胞黏附；检测糖尿病大鼠肾皮质eNOS、亚硝酸盐、EZH2、H3K27me3。
分子动力学模拟分析EZH2-SUZ12界面
从结构角度解释S-亚硝基化削弱SUZ12与EZH2 SAL结构域结合的机制。
基于PDB 5HYN与AlphaFold模型构建EZH2-SUZ12复合体，在C324/C695位点引入S-亚硝基化，进行1 μs GROMACS模拟、RMSD/RMSF、氢键与MM/PBSA结合自由能计算。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| NO供体处理 | 硝普钠二水合物 | Sigma Aldrich | 71778 |
| S-亚硝基谷胱甘肽 | Med Chem Express | HY-D0845 | |
| eNOS诱导 | 缓激肽 | Sigma Aldrich | B3259 |
| 人VEGF165 | Peprotech | 100-20 | |
| NOS抑制 | Nω-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐 | Sigma Aldrich | N5751 |
| 自噬抑制 | 巴弗洛霉素A1 | Cayman Chemicals | 11038 |
| 蛋白酶体抑制 | MG132 | Sigma Aldrich | M7449 |
| 去甲基化酶抑制 | GSK-J4 | Sigma Aldrich | SML-0701 |
| EZH2抑制 | GSK126 | Med Chem Express | HY-13470 |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | HiMedia Laboratories | AL006A |
| 胎牛血清 | HiMedia Laboratories | RM1112 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 10378 | |
| HiEndoXL内皮细胞扩增培养基 | HiMedia Laboratories | AL517 | |
| Eagle最低必需培养基 | HiMedia Laboratories | AT154 | |
| RPMI-1640培养基 | Hi Media | AL028A | |
| 质粒转染 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 11668030 |
| pCMVHA hEZH2质粒 | Addgene | 24230 | |
| RNA干扰 | SignalSilence EZH2 siRNA I | Cell Signaling Technology | 6509 |
| SignalSilence对照siRNA | Cell Signaling Technology | 6568 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific | 15596 |
| 蛋白裂解 | RIPA裂解液 | Cell Signaling Technology | 9806 |
| 免疫印迹 | EZH2单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 5246 |
| SUZ12兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3737 | |
| EED兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 51673 | |
| AEBP2兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 14129 | |
| JARID2兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 13594 | |
| HA标签兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| GAPDH兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| H3兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4499 | |
| S-亚硝基半胱氨酸单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 94930 | |
| 泛素单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3933 | |
| 免疫共沉淀 | SureBeads蛋白A磁珠 | BioRad | 1614013 |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor Plus 480偶联抗兔IgG二抗 | Thermo Fisher Scientific | A32732 |
| 鬼笔环肽-Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 组蛋白甲基转移酶活性检测 | EpiQuik HMT活性/抑制检测试剂盒（H3-K27） | Epigentek | P-3005 |
| cDNA合成 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | 1708891 |
| 实时定量PCR | iTaq通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad Laboratories | 1725124 |
| 染色质免疫沉淀 | Imprint染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | 86652 |
| 定点突变 | Phusion定点突变试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | F541 |
| T4多核苷酸激酶 | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| 质粒提取 | Qiagen质粒小提试剂盒 | Qiagen | 12123 |
| S-亚硝基化检测 | Pierce S-亚硝基化免疫印迹试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 90105 |
| 重组蛋白 | EZH2重组蛋白 | MyBioSource | MBS2097714 |
| 凋亡检测 | Annexin V FITC和碘化丙啶死细胞凋亡试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | V13242 |
| 单核细胞标记 | 3,3′-双十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐 | Thermo Fisher Scientific | D275 |
| 蛋白分子量参照 | 预染蛋白分子量标记 | Genetix | PG-PMT2922 |
| 免疫印迹显影 | Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | 1705061 |
| Clarity Max Western ECL底物 | Bio-Rad | 1705062 | |
| 蛋白酶抑制 | 蛋白酶抑制剂 | Sigma Aldrich | P8340 |
| 糖尿病肾病模型 | 链脲佐菌素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 肾功能检测 | 大鼠白蛋白ELISA试剂盒 | Abcam | ab108789 |
| 肌酐比色检测试剂盒 | Abcam | ab65340 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| NO供体处理与时间点 | SNP 500 μM、GSNO 100 μM的浓度及0、0.5、1、2、4 h时间点；不同细胞系（EA.hy926、HUVEC、HEK-293）的差异 阅读提示：Methods中Inducers and inhibitors小节及Fig. 1、Fig. 2图注 |
| EZH2突变体功能实验 | C260S、C329S、C700S及C329S C700S突变体的构建方式、转染量250 ng/mL及SNP/GSNO处理时间 阅读提示：Methods中Site-directed mutagenesis reaction、Plasmid, siRNA and Transfection小节及Fig. 6图注 |
| PRC2组装检测 | 免疫共沉淀中EZH2抗体用量（1:50）、蛋白上样量1000 μg及0.5 h处理时间点 阅读提示：Methods中Coimmunoprecipitation experiments小节及Fig. 1D、Fig. 2F图注 |
| 降解途径抑制实验 | MG132 1 μM、bafilomycin A1 100 nM的预处理方式与联合使用条件 阅读提示：Methods中Inducers and inhibitors小节及Fig. 4图注 |
| 糖尿病相关模型 | 间歇性高糖25 mM/5.5 mM循环3次共72 h；STZ 55 mg/kg单次尾静脉注射后6周；GSNO 100 μM处理条件 阅读提示：Methods中High glucose treatment condition、Diabetic kidney disease model小节及Fig. 5图注 |
| 分子动力学模拟 | PDB 5HYN与AlphaFold模型来源、C324/C695位点S-亚硝基化处理、1 μs模拟及MM/PBSA参数 阅读提示：Methods中Model and protein preparation for in silico analysis、Molecular dynamics (MD) simulations小节及Fig. 7图注 |