HIRI后Axin1表达变化检测
验证Axin1在HIRI中是否表达上调
分析GEO数据集GSE228781，收集临床正常及缺血再灌注肝组织检测AXIN1表达，构建小鼠HIRI模型检测不同再灌注时间点Axin1表达，分离原代小鼠肝细胞构建H/R模型检测Axin1表达。
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Axin形成抑制剂1通过促进PPARβ的泛素化降解加重肝脏缺血再灌注损伤
Axin formation inhibitor 1 aggravates hepatic ischemia‒reperfusion injury by promoting the ubiquitination and degradation of PPARβ.
实验完整度
高含临床样本、体外H/R模型、转基因小鼠HIRI模型、RNA测序、Co-IP及泛素化等功能与机制验证
主要模型
临床患者正常及缺血再灌注肝组织 原代小鼠肝细胞H/R模型 人正常肝细胞系WRL68 H/R模型 肝细胞特异性Axin1敲除/过表达雄性小鼠HIRI模型
重点核对
小鼠HIRI模型：左中叶肝蒂无创动脉夹阻断75 min后恢复血流，再灌注6 h为后续实验时间点 细胞H/R模型：无糖无血清DMEM，1% O2、5% CO2、94% N2条件下6 h，随后正常氧条件6 h 腺病毒转染MOI=100，8 h后更换正常培养基 肝细胞特异性Axin1敲除（Axin1-HKO）与过表达（Axin1-HTG）小鼠的基因型鉴定及敲低/过表达效率验证 尾静脉注射Axin1敲低腺病毒1×10^9 pfu/只，3天后建立HIRI模型
摘要
肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）是肝切除和肝移植后常见的病理现象。在此，我们旨在探究Axin形成抑制剂1（Axin1）在HIRI中的作用。本研究发现HIRI后Axin1表达上调。细胞实验证实Axin1敲低减轻了缺氧/复氧（H/R）诱导的炎症和凋亡。随后，我们基于转基因肝细胞特异性Axin1敲除和过表达的雄性小鼠构建了HIRI模型，发现Axin1缺失减轻了炎症和凋亡。转录组测序揭示Axin1过表达后表达差异的基因显著富集于PPAR信号通路。此外，我们证明Axin1负调控PPARβ的表达，从而激活NF-κB通路。机制上，Axin1与PPARβ结合，增强E3泛素连接酶RBBP6对PPARβ的泛素化介导的降解。值得注意的是，腺病毒介导的Axin1敲低阻断了小鼠的I/R损伤。我们的研究结果表明，Axin1通过促进PPARβ的泛素化和降解，进而激活NF-κB信号通路，加重HIRI。这些结果提示Axin1可能是HIRI的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Axin1在肝脏缺血再灌注损伤中发挥何种作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- Axin1与PPARβ结合，增强E3泛素连接酶RBBP6对PPARβ的泛素化介导的降解，进而激活NF-κB信号通路，促进炎症和凋亡。
- 主要证据
- 临床HIRI肝组织及小鼠HIRI模型中Axin1表达上调；肝细胞特异性Axin1敲除/过表达小鼠及体外H/R模型的功能实验证实Axin1加重炎症和凋亡；RNA测序、Co-IP、CHX、泛素化实验及RBBP6沉默实验验证了Axin1-PPARβ-RBBP6-NF-κB机制链。
- 研究意义
- 提示Axin1可能是HIRI的潜在治疗靶点，并可能作为有用的预后生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Axin1敲低对H/R诱导肝细胞损伤的影响
验证Axin1敲低是否减轻H/R诱导的肝细胞炎症和凋亡
通过腺病毒载体转染敲低原代肝细胞Axin1，构建H/R模型，检测细胞活力、LDH释放、caspase-3活性、凋亡相关蛋白表达、凋亡细胞比例及炎症因子表达；在WRL68细胞中验证。
Axin1过表达对H/R诱导肝细胞损伤的影响
验证Axin1过表达是否加重H/R诱导的肝细胞炎症和凋亡
构建Axin1过表达腺病毒载体转染原代肝细胞，H/R处理后检测细胞活力、LDH释放、caspase-3活性、凋亡相关蛋白表达、凋亡细胞比例及炎症因子表达；在WRL68细胞中验证。
肝细胞特异性Axin1敲除对小鼠HIRI的影响
在体内验证Axin1敲除是否减轻HIRI
利用CRISPR/Cas9构建Axin1-LoxP小鼠并与Alb-Cre小鼠杂交获得Axin1-HKO小鼠，构建HIRI模型，检测肝坏死、血清ALT/AST/LDH、凋亡相关蛋白、TUNEL阳性细胞、CD11b和Ly6G阳性细胞及炎症因子表达。
肝细胞特异性Axin1过表达对小鼠HIRI的影响
在体内验证Axin1过表达是否加重HIRI
利用CRISPR/Cas9插入Axin1基因片段获得Axin1-HTG小鼠，构建HIRI模型，检测肝坏死、血清ALT/AST/LDH、凋亡相关蛋白、TUNEL阳性细胞、CD11b和Ly6G阳性细胞及炎症因子表达。
Axin1对PPARβ及NF-κB通路的调控
探究Axin1加重HIRI的下游信号机制
对AdVector-H/R和AdAxin1-H/R肝细胞进行RNA测序及GSEA/KEGG分析，检测PPARα/β/γ表达，检测P65、p-P65、IκBα、p-IκBα表达及NF-κB活性。
PPARβ过表达挽救Axin1的促炎促凋亡作用
验证PPARβ是否介导Axin1在HIRI中的功能
在Axin1-HTG小鼠原代肝细胞中转染PPARβ过表达腺病毒并构建H/R模型，检测细胞损伤、凋亡及NF-κB通路；在NTG和Axin1-HTG小鼠中尾静脉注射PPARβ过表达腺病毒并构建HIRI模型，检测肝坏死、ALT/AST、凋亡蛋白及NF-κB通路。
Axin1促进PPARβ泛素化降解的机制验证
验证Axin1是否通过结合PPARβ并招募RBBP6促进其泛素化降解
CHX实验检测PPARβ半衰期，MG132和CQ处理区分降解途径，Co-IP检测PPARβ泛素化水平，免疫荧光检测共定位，分子对接预测结合，截短体Co-IP定位结合区域，Co-IP联合质谱筛选Axin1结合蛋白，与ubibrowser预测的PPARβ E3泛素连接酶取交集，沉默RBBP6检测PPARβ泛素化，K48R突变体实验检测泛素链类型。
Axin1敲低腺病毒对小鼠HIRI的治疗效果
评估靶向Axin1对HIRI的潜在治疗价值
尾静脉注射Axin1敲低腺病毒，3天后构建HIRI模型，检测Axin1表达、肝坏死面积、血清ALT/AST/LDH、TUNEL阳性细胞及凋亡相关蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 凋亡细胞检测 | TUNEL染色试剂 | Roche | -- |
| RNA提取 | 总RNA制备试剂盒 | Axygen | -- |
| cDNA合成 | 逆转录试剂盒 | TOYOBO | -- |
| qRT-PCR | SYBR qPCR预混液 | Roche | -- |
| Applied Biosystems 7500HT实时PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | Merck Millipore Ltd. | -- |
| IRDye 800CW二抗 | LI-COR | 925-32210 | |
| Odyssey成像系统 | LI-COR | -- | |
| Axin1抗体 | Cell Signaling Technology | 2087 | |
| PPARα抗体 | Proteintech | 66826-1-Ig | |
| PPARβ抗体 | Proteintech | 60193-1-Ig | |
| PPARβ抗体 | Santa Cruz | sc-74517 | |
| PPARγ抗体 | Proteintech | 16643-1-AP | |
| RBBP6抗体 | Proteintech | 11882-1-AP | |
| 磷酸化IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 2859 | |
| IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 4812 | |
| 磷酸化P65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| P65抗体 | Cell Signaling Technology | 4764 | |
| Bax抗体 | Cell Signaling Technology | 2772 | |
| Bcl-2抗体 | Cell Signaling Technology | 3498 | |
| cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| FLAG抗体 | Proteintech | 66008-4-Ig | |
| His抗体 | Proteintech | 66005-1-Ig | |
| HA抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| 泛素抗体 | Santa Cruz | sc-166553 | |
| GAPDH抗体 | Kangcheng | KC-5G4 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Servicebio | G4103 |
| caspase-3活性检测 | caspase-3活性检测试剂盒 | Beyotime | C1115 |
| 凋亡细胞检测 | 凋亡细胞检测试剂盒 | Beyotime | C1062S |
| ELISA | IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 腺病毒载体构建 | 腺病毒载体 | Hanbio Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 质粒构建 | pcDNA3.1-Flag、pcDNA3.1-His、pcDNA3.1质粒 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | -- |
| 质粒转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | -- | -- |
| RNA测序 | BGISEQ-500测序平台 | MGI Tech Co., Ltd. | -- |
| NF-κB活性检测 | NF-κB质粒 | Beyotime | -- |
| pRL-SV40-N质粒 | Beyotime | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 血清ALT/AST检测 | ALT和AST检测试剂盒 | Nanjingjiancheng Company | -- |
| 血清LDH检测 | LDH检测试剂盒 | Nanjingjiancheng Company | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠HIRI模型 | 麻醉剂2%戊巴比妥钠50 mg/kg；左中叶肝蒂阻断75 min；再灌注6 h为后续实验时间点；Sham组不阻断血流 阅读提示：Methods中Mouse HIRI model小节及Fig. 1H、1I图注 |
| 细胞H/R模型 | 无糖无血清DMEM；1% O2、5% CO2、94% N2条件下6 h；复氧正常氧条件6 h；WRL68细胞来源iCell-h227 阅读提示：Methods中Cell hypoxia/reoxygenation (H/R) model小节及Fig. 2C、3B图注 |
| 腺病毒转染 | MOI=100；转染8 h后更换正常培养基；Axin1敲低、过表达及PPARβ过表达腺病毒购自Hanbio 阅读提示：Methods中Construction and transfection of adenovirus小节 |
| 肝细胞特异性Axin1敲除/过表达小鼠构建 | Axin1-HKO：敲除exon2-exon9，ES细胞背景C57BL/6JGpt；Axin1-HTG：插入Axin1-201 CDS（2592 nt，863 aa）至H11位点；均与Alb-Cre或经CRISPR/Cas9获得 阅读提示：Methods中Animals小节及Fig. 4A、5A、Fig. S3、S5 |
| 尾静脉注射Axin1敲低腺病毒 | 剂量1×10^9 pfu/只；注射后3天建立HIRI模型 阅读提示：Methods中Intravenous injection into the mouse tail vein小节及Fig. S14A图注 |
| CHX实验 | CHX浓度20 μM；按指定时间点收集细胞 阅读提示：Methods中CHX assay小节及Fig. 8A、8B图注 |
| 临床样本收集 | 肝部分切除良性肝病患者；缺血30–60 min，再灌注1–2 h；样本冻存于−80 °C 阅读提示：Methods中Human liver samples小节及Fig. 1B图注 |