冷刺激下白色脂肪组织内体系统基因表达分析
鉴定白色脂肪褐变过程中内体系统相关基因的动态变化
对室温或4°C冷刺激3天的WT小鼠ingWAT进行bulk RNA-seq，分析差异表达基因和内体相关基因；并用冷刺激及复温实验验证Sort1和UCP1表达变化
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Sortilin介导的线粒体ACSL1易位损害雄性小鼠脂肪细胞产热和能量消耗
Sortilin-mediated translocation of mitochondrial ACSL1 impairs adipocyte thermogenesis and energy expenditure in male mice.
实验完整度
高包含体外脂肪细胞模型、脂肪特异性基因敲除小鼠、AAV局部敲低/过表达、药物抑制及人脂肪组织样本，并进行功能与机制验证
主要模型
永生化小鼠ingWAT-SVF脂肪细胞（iWAT细胞） 永生化小鼠BAT-SVF脂肪细胞（iBAT细胞） 人皮下脂肪来源SVF细胞（HumanWAT细胞） 脂肪细胞特异性Sort1敲除小鼠（Sort1adipoKO）
重点核对
iWAT细胞经shRNA敲低Sort1后诱导脂肪分化8天，检测产热基因和UCP1/PGC1α蛋白及OCR Sort1adipoKO小鼠在30°C和22°C下的全身耗氧量（VO2）和呼吸交换率（RER） Sort1adipoKO小鼠高脂饮食（60%脂肪）8-12周后的体重、脂肪量和葡萄糖/胰岛素耐量 shSort1脂肪细胞经AMPK抑制剂Compound C（10 μM，2小时）或AMPK-DN质粒处理后的UCP1诱导 AF38469以0.4 μg/ml饮用水给药，预计5-10 μg/天/小鼠
摘要
米色脂肪激活涉及慢性冷适应后向脂肪酸氧化的燃料转换。线粒体酰基辅酶A合成酶长链家族成员1（ACSL1）定位于线粒体，在脂肪酸氧化中起关键作用；然而，其亚细胞定位的调控机制尚不清楚。在这里，我们在脂肪组织中鉴定了一种内体运输组件sortilin（由Sort1编码），其在米色脂肪激活过程中表现出动态表达，并促进ACSL1从线粒体易位至内溶酶体途径进行降解。脂肪细胞中sortilin的缺失导致线粒体ACSL1增加和AMPK/PGC1α信号激活，从而激活米色脂肪并预防高脂饮食（HFD）诱导的肥胖和胰岛素抵抗。总之，我们的发现表明sortilin通过底物燃料选择在米色脂肪激活过程中控制脂肪组织脂肪酸氧化，并为代谢疾病的治疗提供了潜在的靶向方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Sortilin是否以及如何调控脂肪细胞产热和能量消耗，其与线粒体ACSL1亚细胞定位的关系是什么？
- 核心机制
- Sortilin促进线粒体ACSL1向内体/溶酶体途径易位并降解，降低线粒体ACSL1水平，从而抑制AMPK/PGC1α信号和米色脂肪产热；Sortilin缺失则增加线粒体ACSL1，激活AMPK/PGC1α信号。
- 主要证据
- 体外shSort1/siSORT1脂肪细胞和体内Sort1adipoKO、AAVshSort1小鼠中产热基因和UCP1/PGC1α升高；LC-MS/MS和Co-IP证实sortilin与ACSL1相互作用；CHX chase和溶酶体抑制剂实验证实sortilin介导ACSL1溶酶体降解；Acsl1KO和AAVshAcsl1实验表明ACSL1是sortilin缺失促褐变的下游效应分子。
- 研究意义
- 揭示sortilin通过调控线粒体ACSL1蛋白丰度和底物燃料选择控制脂肪组织脂肪酸氧化，为代谢疾病治疗提供潜在靶向策略；sortilin抑制剂AF38469在饮食诱导肥胖小鼠中减轻体重并改善胰岛素抵抗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Sortilin缺失对白色脂肪细胞褐变的功能验证
验证sortilin缺失是否促进白色脂肪褐变
在iWAT细胞和HumanWAT细胞中敲低sortilin，检测产热基因、UCP1/PGC1α蛋白和OCR；构建Sort1adipoKO小鼠和AAVshSort1小鼠，检测产热基因、冷耐受和能量代谢
Sortilin缺失对高脂饮食诱导肥胖和代谢紊乱的影响
评估脂肪特异性sortilin缺失对HFD诱导肥胖和胰岛素抵抗的作用
Sort1adipoKO和AAVshSort1小鼠接受高脂饮食8-12周，检测体重、体成分、脂肪组织重量、GTT、ITT和肝脏脂质
AMPK信号在sortilin缺失促褐变中的作用验证
确定sortilin缺失促白色脂肪褐变是否依赖AMPK信号
对shSort1脂肪细胞使用AMPK抑制剂Compound C、AMPK-DN、p38 MAPK抑制剂和脂肪酶抑制剂，检测UCP1和p-AMPK等蛋白；检测Sort1adipoKO小鼠ingWAT中AMP/ATP和ADP/ATP比值及代谢物
Sortilin与ACSL1相互作用及ACSL1降解机制鉴定
鉴定sortilin下游效应蛋白并验证sortilin调控ACSL1蛋白稳定性
用sortilin抗体免疫共沉淀结合LC-MS/MS鉴定互作蛋白；Co-IP和免疫荧光验证sortilin与ACSL1相互作用；CHX chase检测ACSL1半衰期；分离线粒体和胞质组分检测ACSL1分布；溶酶体抑制剂处理验证降解途径
ACSL1在sortilin缺失促褐变中的下游作用验证
验证ACSL1是否介导sortilin缺失对白色脂肪褐变和能量代谢的促进作用
构建ingWAT特异性ACSL1过表达小鼠（AAVAcsl1）；在WT和Acsl1KO小鼠中局部敲低sortilin；在Sort1fl/fl和Sort1adipoKO小鼠中尾静脉注射AAVshAcsl1，检测冷耐受、产热基因、p-AMPK和VO2
Sortilin抑制剂AF38469对白色脂肪褐变和代谢的影响
评估药理学抑制sortilin是否促进白色脂肪褐变并改善代谢
体外用AF38469处理脂肪细胞检测产热基因和OCR；体内给予AF38469饮用水处理小鼠，检测ingWAT中ACSL1、p-AMPK和UCP1蛋白、VO2以及HFD下的体重、脂肪量和GTT/ITT
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM-F12培养基 | Gibco | 11320033 |
| 牛血清白蛋白 | BIU4O | 9048-46-8 | |
| I型胶原酶 | Biosharp | BS163 | |
| 红细胞裂解液 | Solarbio | R1010 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| 脂肪分化 | 三碘甲状腺原氨酸 | Sigma | T2877 |
| 罗格列酮 | Sigma | R2408 | |
| 胰岛素 | Sigma | I5523 | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma | I7018 | |
| 地塞米松 | Sigma | D4902 | |
| 吲哚美辛 | Sigma | I7378 | |
| Western blot | 抗Sortilin抗体 | Proteintech | 12369-1 |
| 抗ACSL1抗体 | Proteintech | 13989-1 | |
| 抗α-Tubulin抗体 | Proteintech | 11224-1 | |
| 抗UCP1抗体 | Abcam | ab234430 | |
| 抗AMPK抗体 | CST | 2532 | |
| 抗磷酸化AMPK Thr172抗体 | CST | 2531 | |
| 抗p38MAPK抗体 | CST | 9212 | |
| 抗磷酸化p38MAPK Thr180/Tyr182抗体 | CST | 4511 | |
| 抗HSL抗体 | ABclonal | A15686 | |
| 抗磷酸化HSL Ser660抗体 | ABclonal | AP1432 | |
| 抗PGC1α抗体 | ABclonal | A12348 | |
| 免疫荧光 | 抗LAMP1抗体 | Abcam | ab208943 |
| 抗EEA1抗体 | Proteintech | 28347-1 | |
| 抗TOM20抗体 | HUABIO | ET1609-25 | |
| 免疫共沉淀 | Pierce经典磁珠免疫沉淀/共免疫沉淀试剂盒 | Thermo Scientific | 88804 |
| Western blot | RIPA裂解液 | BIU4O | B1025 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | MCE | HY-K0010 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | MCE | HY-K0021 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | BOSTER | AR0197 | |
| 亚细胞组分分离 | 线粒体分离和蛋白提取试剂盒 | Proteintech | PK10016 |
| 体外化合物处理 | Compound C | MCE | HY-13418A |
| Atglistatin | MCE | HY-15859 | |
| CAY10499 | MCE | HY-119283 | |
| SB203580 | MCE | HY-10256 | |
| SB202190 | MCE | HY-10295 | |
| 氯化铵 | MCE | HY-Y1269 | |
| 氯喹 | MCE | HY-17589A | |
| 3-甲基腺嘌呤 | MCE | HY-19312 | |
| MG132 | MCE | HY-13259 | |
| 质粒转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen/Life Technologies | L3000008 |
| 动物实验 | AF38469 | MCE | HY-12802 |
| CL316,243 | Sigma | C5976 | |
| 高脂饮食 | Research Diet | D12492 | |
| 代谢分析 | 综合实验室动物监测系统 | Columbus Instruments | CLAMS |
| 体成分分析 | Echo磁共振成像体成分分析仪 | Echo Medical System | -- |
| 脂肪组织体积成像 | Bruker微型CT Skyscan 1276 | Bruker | -- |
| 红外热成像 | 红外热像仪 | FLIR | T1010 |
| OCR检测 | Agilent Seahorse XFe24分析仪 | Agilent | -- |
| 细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | -- | |
| RNA提取 | TRI试剂 | Sigma | T9424 |
| RNA质检 | RNA 6000 Nano试剂盒 | Agilent | 5067-1511 |
| RT-qPCR | HiScript II Q RT SuperMix | Vazyme | R222-01 |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| 油红O染色 | 油红O工作液 | Servicebio | G1015 |
| 考马斯亮蓝染色 | 考马斯亮蓝染色液 | Solarbio | P1305 |
| 血清脂质检测 | 血清甘油三酯ELISA试剂盒 | NJBI | A110-1-1 |
| 血清总胆固醇ELISA试剂盒 | NJBI | A111-1-1 | |
| 血清高密度脂蛋白ELISA试剂盒 | NJBI | A112-1-1 | |
| 血清低密度脂蛋白ELISA试剂盒 | NJBI | A113-1-1 | |
| 血清游离脂肪酸ELISA试剂盒 | NJBI | A042-2-1 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 冷刺激与复温实验 | 冷刺激温度4°C、持续时间3天、复温条件、每组样本量n=6 阅读提示：Results第一段及Fig. 1f–h图注 |
| 脂肪细胞分化 | 诱导分化8天；iWAT细胞分化培养基含1 nM T3、0.5 μM rosiglitazone、5 μg/mL insulin、0.5 mM IBMX、2 μg/mL dexamethasone、0.125 mM Indomethacin处理2天；维持培养基成分 阅读提示：Methods中Cell lines小节 |
| Sort1adipoKO小鼠构建与验证 | Sort1flox/flox与Adiponectin-Cre杂交；敲除区域为exon 2和exon 3；对照组为不表达Cre的littermates；每组n=6 阅读提示：Methods中Animals小节及Fig. 2g–i图注 |
| 高脂饮食诱导肥胖实验 | 5周龄C57BL/6J小鼠给予60%脂肪高脂饮食（D12492）8-12周；每组n=6 阅读提示：Methods中Animals小节及Fig. 3图注 |
| AF38469给药 | AF38469饮用水浓度0.4 μg/ml，预计5-10 μg/天/小鼠；每周换水；每组n=6 阅读提示：Methods中Animals小节及Fig. 7图注 |
| CL316,243处理 | 单次腹腔注射或连续注射7天，剂量1 mg/kg体重 阅读提示：Methods中Animals小节及Fig. 6e、j图注 |
| AMPK抑制剂和AMPK-DN实验 | Compound C浓度10 μM处理2小时；AMPK-DN质粒转染24小时；每组n=4 阅读提示：Methods中In vitro compound treatment小节及Fig. 4e、f图注 |
| LC-MS/MS鉴定sortilin互作蛋白 | 500 μg蛋白与10 μg抗sortilin抗体或抗ACSL1抗体4°C过夜免疫沉淀；对照组排除；共鉴定394个蛋白 阅读提示：Methods中Immunoprecipitation小节及Fig. 5a–d图注 |