患者ILC3s中Wnt/β-catenin信号分析
探究IBD和CRC患者ILC3s中Wnt/β-catenin信号是否失调
重新分析IBD和CRC患者结肠组织scRNA-seq数据，比较ILC3s中CTNNB1及Wnt下游基因表达
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Wnt/β-catenin信号失调通过调控3型先天淋巴细胞促进肠道炎症
Dysregulation of Wnt/β-catenin signaling contributes to intestinal inflammation through regulation of group 3 innate lymphoid cells.
实验完整度
高包含患者scRNA-seq数据、体外细胞实验、多种基因工程小鼠模型、骨髓嵌合体及表观遗传学机制验证
主要模型
IBD和CRC患者结肠组织scRNA-seq数据 小鼠肠道ILC3s体外培养 RorccreCtnnb1ex3fl/wt小鼠 CreERT2Ctnnb1ex3fl/wt小鼠
重点核对
CHIR-99021处理ILC3s的剂量为20 μM，处理24小时 DSS诱导结肠炎：3%或2.5% DSS饮水5天 C. rodentium感染：2×10^9 CFU灌胃 骨髓嵌合体：CD45.1+和CD45.1+CD45.2+细胞1:1混合，移植入经致死照射的Rag2–/–Il2rg–/–受体 他莫昔芬诱导：75 mg/kg体重腹腔注射，每日一次，连续5天
摘要
RORγt+ 3型先天淋巴细胞（ILC3s）对肠道稳态至关重要。在炎症性肠病和结直肠癌患者的肠道中已发现ILC3s失调，但其具体机制仍需进一步研究。本研究发现，与健康供者相比，炎症性肠病和结肠癌患者肠道ILC3s中的β-catenin增加。与在T细胞中促进RORγt表达相反，ILC3s中Wnt/β-catenin信号激活会抑制RORγt表达，抑制其增殖和功能，并导致小鼠ILC3s缺陷及随后的肠道炎症。活化的β-catenin及其相互作用的转录因子TCF-1不能直接抑制RORγt表达，而是改变整体染色质可及性并抑制JunB表达，而JunB对ILC3s中RORγt表达至关重要。总之，我们的发现表明，Wnt/β-catenin信号失调通过TCF-1/JunB/RORγt调控损害肠道ILC3s，进一步破坏肠道稳态，并促进炎症和癌症。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Wnt/β-catenin信号在ILC3s中是否失调，以及其如何影响ILC3s和肠道炎症？
- 核心机制
- 活化的β-catenin与TCF-1结合，改变染色质可及性和组蛋白修饰，抑制JunB表达，进而降低RORγt表达，导致ILC3s缺陷和功能障碍。
- 主要证据
- 患者scRNA-seq显示ILC3s中Wnt/β-catenin信号升高；体外CHIR-99021处理抑制ILC3s的RORγt表达、活力和细胞因子产生；RorccreCtnnb1ex3fl/wt小鼠ILC3s减少且DSS结肠炎加重；表观遗传学及CUT&Tag、ATAC-seq、Luciferase实验验证TCF-1/JunB/RORγt调控轴。
- 研究意义
- 揭示Wnt/β-catenin信号在先天和适应性淋巴细胞中的不同调控机制，为IBD和癌症提供潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外激活Wnt/β-catenin信号对ILC3s和T细胞的影响
验证Wnt/β-catenin激活对ILC3s和T细胞RORγt表达及功能的差异影响
分离小鼠肠道ILC3s和naïve T细胞诱导的Th17/Treg，用CHIR-99021或Wnt ligands处理，流式检测β-catenin、RORγt、活力、细胞因子
基因工程激活β-catenin对小鼠ILC3s的影响
在体内验证β-catenin激活对ILC3s数量、亚群和功能的影响
构建RorccreCtnnb1ex3fl/wt小鼠，8周龄时分析结肠、小肠、mLN中ILC3s数量、亚群和细胞因子产生
骨髓嵌合体验证ILC3s缺陷的细胞内在性
确定β-catenin激活是否细胞内在性抑制ILC3s
将CD45.1+ WT与CD45.1+CD45.2+ KO或对照骨髓细胞1:1混合，移植入致死照射Rag2–/–Il2rg–/–受体，6周后分析肠道ILC3s
DSS诱导结肠炎模型评估β-catenin激活对肠道炎症的影响
验证ILC3s中β-catenin激活是否增加结肠炎易感性
给予RorccreCtnnb1ex3fl/wt和对照小鼠3%或2.5% DSS饮水5天，监测体重、生存、结肠病理和ILC3s数量功能；并通过ILC3s回补和Rag1–/–背景排除T细胞影响
C. rodentium感染性结肠炎模型验证
验证ILC3s中β-catenin激活对感染性结肠炎的影响
口服灌胃C. rodentium DBS100，监测体重、粪便病原载量、血液播散和结肠病理，流式检测ILC3s和IL-22
β-catenin激活对ILC3s存活和增殖的影响
探究Wnt/β-catenin信号调控ILC3s存活和增殖的机制
使用CreERT2Ctnnb1ex3fl/wt ILC3s，4-羟基他莫昔芬处理，检测β-catenin、RORγt表达、细胞死亡、Ki-67和CFSE稀释；并进行RNA-seq和GO分析
表观遗传学机制解析
揭示β-catenin激活如何通过表观遗传调控抑制RORγt表达
对Ctrl和KO ILC3s进行CUT&Tag（H3K4me3、H3K27ac、TCF-1、NFATc2、JunB、pol II）和ATAC-seq，结合RNA-seq和Luciferase报告基因实验，分析Rorc locus及Junb/Nfatc2调控
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | CHIR-99021 | Selleck | S1263 |
| 4-羟基他莫昔芬 | MCE | HY-16950 | |
| 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | MCE | HY-18739 | |
| 离子霉素 | MCE | HY-13434 | |
| 布雷非德菌素A | MCE | HY-16592 | |
| 重组小鼠IL-2 | Novoprotein | CK24 | |
| 重组小鼠IL-7 | Novoprotein | CC73 | |
| 重组小鼠SCF | Novoprotein | C775 | |
| 流式分析 | CD127抗体（克隆A7R34） | BioLegend | 135023 |
| CD90.2抗体（克隆30-H12） | BioLegend | 105335 | |
| CD45抗体（克隆30-F11） | BioLegend | 103128 | |
| RORγt抗体（克隆B2D） | Thermo Fisher Scientific | 12-6988-82 | |
| β-catenin抗体（克隆15B8） | Thermo Fisher Scientific | 12-2567-42 | |
| Ki-67抗体（克隆SolA15） | Thermo Fisher Scientific | 12-5698-82 | |
| Western blot | GAPDH抗体 | Beyotime | AF2819 |
| TCF-1抗体（克隆C63D9） | Cell Signaling Technology | 2203 | |
| β-catenin抗体 | BD | 610154 | |
| JunB抗体（克隆C37F9） | Thermo Fisher Scientific | PA1-835 | |
| NFATc2抗体（克隆25A10.D6.D2） | Thermo Fisher Scientific | MA1-025 | |
| CUT&Tag | 抗三甲基化组蛋白H3（Lys4）抗体（克隆C42D8） | Cell Signaling Technology | 9751 |
| 抗乙酰化组蛋白H3（Lys27）抗体（克隆D5E4） | Cell Signaling Technology | 8173 | |
| 抗磷酸化Rpb1 CTD（Ser5）抗体（克隆D9N5I） | Cell Signaling Technology | 13523 | |
| 兔IgG同型对照 | Abcam | ab37415 | |
| 小鼠IgG1同型对照（克隆G3A1） | Cell Signaling Technology | 5415 | |
| 免疫荧光 | EpCAM抗体（克隆323/A3） | Thermo Fisher Scientific | MA5-12436 |
| E-cadherin抗体（克隆DECMA-1） | Thermo Fisher Scientific | 53-3249-82 | |
| CD45抗体（克隆EP322Y） | Abcam | ab40763 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| 组织消化 | Liberase | Roche | 05401020001 |
| DNase I | Sigma | DN25 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma | D0632 | |
| DSS诱导结肠炎 | 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | -- |
| C. rodentium感染 | C. rodentium菌株DBS100 | ATCC | 51459 |
| RNA提取 | TRIzol | Invitrogen | -- |
| qPCR | Hieff qPCR SYBR Green Master Mix | YEASEN | -- |
| ATAC-seq | Novoprotein Chromatin Profile Kit for Illumina | Novoprotein | -- |
| CUT&Tag | YEASEN NovoNGS CUT&Tag 3.0 高灵敏度试剂盒（用于Illumina） | YEASEN | -- |
| Luciferase实验 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 双荧光素酶检测系统 | Promega | -- | |
| 细胞分选 | FACSAria流式细胞分选仪 | BD Bioscience | -- |
| 流式分析 | Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外ILC3s激活Wnt/β-catenin信号 | CHIR-99021浓度20 μM，处理时间24小时；ILC3s培养于OP9饲养层，含IL-2 10 ng/ml和IL-7 20 ng/ml 阅读提示：Methods中'ILC2 and ILC3 culture in vitro'及Figure 1图注 |
| DSS诱导结肠炎模型 | DSS浓度3%（w/v）或2.5%（w/v），饮水5天；小鼠8周龄；每组n=5或n=6-8 阅读提示：Methods中'DSS-induced colitis model'及Figure 3图注 |
| C. rodentium感染性结肠炎模型 | C. rodentium DBS100灌胃剂量2×10^9 CFU/200 μL PBS；每2天测体重 阅读提示：Methods中'C. rodentium infectious colitis model'及Supplementary Fig. 4 |
| 骨髓嵌合体实验 | 骨髓细胞1:1混合；受体经5.5 Gy×2致死照射；重建6周；每组n=6 阅读提示：Methods中'Construction of bone marrow chimeras'及Figure 2i-k图注 |
| 他莫昔芬诱导CreERT2 | 他莫昔芬剂量75 mg/kg体重，腹腔注射，每日一次，连续5天；ILC3s转移3×10^5细胞/小鼠 阅读提示：Methods中'Adoptive transfer of ILC3 and tamoxifen treatment'及Supplementary Fig. 5 |
| RNA-seq分析 | CHIR-99021 20 μM处理24小时；差异基因分析用DESeq2 阅读提示：Methods中'RNA-Seq and data analysis'及Figure 4j-k |
| CUT&Tag和ATAC-seq | CUT&Tag使用1×10^5细胞，ATAC-seq使用2×10^4细胞；4-羟基他莫昔芬处理9天 阅读提示：Methods中'CUT&Tag assay'和'ATAC-seq assay'及Figure 5-7图注 |