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        分析粪菌移植后结肠黏膜反应鉴定GBP5在人类和小鼠结肠炎中的作用

        Profiling the colonic mucosal response to fecal microbiota transplantation identifies a role for GBP5 in colitis in humans and mice.

        作者信息Laurence D W Luu, Abhimanu Pandey, Sudarshan Paramsothy, Chinh Ngo, Natalia Castaño-Rodríguez, Cheng Liu, Michael A Kamm, Thomas J Borody, Si Ming Man, Nadeem O Kaakoush
        PMID38531874
        期刊Nat Commun
        发布时间2024-03-26
        DOI10.1038/s41467-024-46983-5
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含人结肠黏膜转录组分析（FMT vs 安慰剂，n=26患者）和Gbp5-/-小鼠DSS结肠炎模型，进行了基因表达、通路、剪接、微生物组及蛋白验证

        主要模型

        溃疡性结肠炎患者结肠黏膜活检样本 雌性C57BL/6NcrlAnu背景Gbp5-/-小鼠及其野生型同窝仔鼠 DSS诱导的小鼠实验性结肠炎模型

        重点核对

        FMT组n=26例患者，安慰剂组n=8例患者；应答者与无应答者按1:1匹配（n=13 vs 13） 小鼠：雌性8-10周龄，WT n=12，Gbp5-/- n=14；1.5% DSS饮水6天，随后正常饮水4天，第10天处死 RNA测序：60个样本，核糖体RNA去除后 shotgun 测序，Illumina NovaSeq 6000 S2 2×100 bp 差异表达分析：DESeq2，显著性阈值q<0.05（部分分析q<0.1）；通路分析：GAGE 免疫印迹：检测P-IRF4/T-IRF4比值，n=5只/组；免疫组化：claudin 2，n=6只/组

        摘要

        溃疡性结肠炎中宿主对粪菌移植（FMT）的分子反应尚不清楚。本研究分析了FMT或安慰剂治疗前后人类结肠黏膜转录组，以鉴定疾病缓解过程中受调控的分子。FMT对转录组的影响超过安慰剂效应（n=75 vs 3个基因，q<0.05），包括对结构、代谢和炎症通路的调节。这种反应主要归因于应答者，在无应答者中未观察到一致性。应答者中受调控的通路包括紧密连接、钙信号和异源物质代谢。FMT后应答者中显著纵向调控的基因可在基线时区分应答者和无应答者，以及FMT后的无应答者，其中GBP5和IRF4的下调与缓解相关。缺乏GBP5的雌性小鼠比野生型同窝仔鼠更能抵抗结肠炎的发展，显示结肠IRF4磷酸化水平更高。结肠黏膜反应可区分FMT后的UC缓解，GBP5在结肠炎中起有害作用。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        溃疡性结肠炎患者对粪菌移植的宿主结肠黏膜分子反应如何，以及哪些分子与疾病缓解相关？
        核心机制
        FMT调节结肠黏膜转录组，尤其在应答者中下调GBP5和IRF4，GBP5缺失在小鼠中增加IRF4磷酸化并上调紧密连接蛋白claudin 2，从而减轻结肠炎。
        主要证据
        人结肠黏膜转录组显示FMT显著调控75个基因（q<0.05），应答者中78个基因显著变化而None in non-responders；GBP5和IRF4下调与缓解相关；Gbp5-/-小鼠DSS结肠炎模型中体重和结肠长度显著高于WT，IRF4磷酸化比率升高，近端结肠claudin 2表达增加。
        研究意义
        结肠黏膜反应可区分FMT后的UC缓解，GBP5在结肠炎中起有害作用，提示其作为宿主生物标志物的潜力。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        人结肠黏膜转录组分析

        鉴定FMT前后及与安慰剂相比差异表达的基因和通路

        对溃疡性结肠炎患者基线、FMT后和安慰剂后的结肠黏膜活检样本进行RNA测序，比较FMT与安慰剂的基因表达和通路变化。

        2

        应答者与无应答者比较分析

        确定FMT诱导的黏膜反应是否与临床缓解相关

        按临床结局将患者分为应答者和无应答者，比较FMT前后基因表达、可变剪接和通路变化。

        3

        GBP5和IRF4作为缓解标志物的验证

        评估纵向调控基因在横断面区分应答者和无应答者的能力

        利用应答者中显著调控的78个基因进行PCoA、CAP和PERMANOVA分析，鉴定与缓解相关的基因。

        4

        GBP5与黏膜微生物群的相关性分析

        探究GBP5表达与细菌分类群的关系

        对黏膜16S rRNA基因扩增子测序数据与GBP5和IRF4表达进行Pearson相关分析。

        5

        Gbp5-/-小鼠DSS结肠炎模型

        验证GBP5在结肠炎发展中的功能作用

        雌性Gbp5-/-和WT同窝仔鼠给予1.5% DSS饮水6天，随后正常饮水4天，监测体重、结肠长度和组织学评分。

        6

        小鼠结肠组织蛋白和紧密连接分析

        探究GBP5缺失对IRF4磷酸化和紧密连接蛋白claudin 2的影响

        对小鼠结肠组织进行免疫印迹检测IRF4磷酸化，免疫组化检测claudin 2表达。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        16S rRNA基因扩增子测序ITS区域扩增子测序RNA测序
        验证分子表达变化
        免疫印迹免疫组织化学
        评估体内效果
        DSS诱导结肠炎模型组织学评分
        数据分析与统计
        DESeq2差异表达分析GAGE通路分析rMATS可变剪接分析主坐标分析主坐标典型分析置换多元方差分析相似性分析CIBERSORTx细胞类型丰度估计

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        RNA提取Nucleospin RNA分离试剂盒Macherey-Nagel740955
        DNA酶处理On-Spin柱DNA酶试剂盒MOBIO15100
        RNA纯化RNA纯化试剂盒Macherey-Nagel740948
        RNA测序文库制备TruSeq链特异性总RNA-seq Ribo-zero GoldIlluminaRS-122-2301
        测序Illumina NovaSeq 6000测序仪Illumina--
        DSS结肠炎模型葡聚糖硫酸钠MP Biomedicals160110
        蛋白定量Pierce BCA蛋白定量试剂盒ThermoFisher Scientific23227
        免疫印迹β-肌动蛋白抗体Cell Signalling Technology4970
        GBP5抗体----
        磷酸化Src (Tyr527)抗体New England Biolabs2105S
        Src抗体New England Biolabs2108S
        磷酸化ERK1/2 Thr202/Tyr204抗体Cell Signalling Technology9101
        ERK1/2抗体Cell Signalling Technology9102
        磷酸化IkB抗体Cell Signaling Technology2859
        IkB抗体Cell Signaling Technology9242
        IRF1抗体Cell Signaling Technology8478
        磷酸化IRF3抗体Cell Signaling Technology4947
        IRF3抗体Cell Signaling Technology4302
        磷酸化IRF4 Tyr122/Tyr125抗体ThermoFisher ScientificPA5105214
        IRF4抗体New England Biolabs4948S
        IRF5抗体Abcamab33478
        IRF8抗体Cell Signaling Technology5628
        磷酸化STAT1抗体Cell Signaling Technology9167
        STAT1抗体Cell Signaling Technology14994
        磷酸化STAT3抗体Cell Signaling Technology9145
        STAT3抗体Cell Signaling Technology9139
        过氧化物酶AffiniPure二抗Jackson ImmunoResearch111-035-045
        过氧化物酶AffiniPure二抗Jackson ImmunoResearch115-035-146
        Clarity Western ECL底物Bio-Rad1705061
        SuperSignal West Atto超高灵敏度底物ThermoFisher ScientificA38554
        免疫组化claudin 2抗体Abcamab53032
        β-肌动蛋白抗体Abcamab8226
        罗丹明RedTM-X偶联二抗Jackson ImmunoResearch111-295-144
        Alexa Fluor 488 AffiniPure二抗Jackson ImmunoResearch115-545-003
        DAPISigma-AldrichD9542
        ProLong Gold抗淬灭封片剂ThermoFisher ScientificP36930
        粪便DNA提取QIAamp PowerFecal Pro DNA试剂盒Qiagen51804

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        人结肠黏膜转录组分析
        患者分组：FMT组n=26，安慰剂组n=8；应答者与无应答者按1:1匹配（n=13 vs 13）；采样时间点：基线（Tx0）、FMT后（Tx8）、安慰剂后（P8）
        阅读提示：Methods - Study cohort；Fig. 1A
        RNA测序与数据分析
        测序平台：Illumina NovaSeq 6000 S2 2×100 bp；差异表达分析：DESeq2，q<0.05；通路分析：GAGE
        阅读提示：Methods - RNA extraction from mucosal biopsies and shotgun sequencing；Methods - Raw data and statistical analysis
        DSS诱导小鼠结肠炎模型
        小鼠品系：C57BL/6NcrlAnu背景Gbp5-/-和WT；性别：雌性；年龄：8-10周龄；DSS浓度：1.5%；DSS饮水时间：6天，随后正常饮水4天；样本量：WT n=12，Gbp5-/- n=14
        阅读提示：Methods - Gbp5–/– mice and experimental colitis model；Fig. 4A
        免疫印迹分析
        蛋白上样量：15-20 μg；抗体稀释比例：GBP5 1:1000，P-IRF4 Tyr122/Tyr125（ThermoFisher Scientific #PA5105214）；样本量：n=5只/组
        阅读提示：Methods - Immunoblotting analysis of mouse colon tissue；Fig. 5A
        免疫组化分析
        抗体：claudin 2（1:100；Abcam ab53032），β-actin（1:200；Abcam ab8226）；样本量：n=6只/组；检测区域：近端结肠
        阅读提示：Methods - Immunohistochemistry；Fig. 5B,C
        黏膜微生物群分析
        16S rRNA基因V1-3区域测序；样本量：n=58；相关性分析：Pearson相关，FDR校正
        阅读提示：Methods - Human mucosal microbiota profiling and analysis；Supplementary Fig. 5

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