构建E3泛素连接酶敲除细胞文库
建立用于筛选RLR通路调控因子的E3敲除细胞资源。
利用CRISPR-Cas9在2fTGH-ISRE-Luc细胞中构建375个E3泛素连接酶敲除细胞系，并通过T7EI验证编辑效率。
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UBR5通过解除RIG-I样受体的转录刹车促进抗病毒免疫
UBR5 promotes antiviral immunity by disengaging the transcriptional brake on RIG-I like receptors.
实验完整度
高包含体外细胞系、原代细胞、基因敲除小鼠模型及病毒感染的体内功能验证，并有机制验证。
主要模型
2fTGH-ISRE-Luc人纤维肉瘤细胞系 HEK293T人胚胎肾细胞系 小鼠原代胚胎成纤维细胞和骨髓来源巨噬细胞 Ubr5诱导性敲除小鼠模型
重点核对
E3敲除文库筛选：375个泛素连接酶敲除2fTGH-ISRE-Luc细胞系，以poly(I:C)、ISD或IFN-β刺激后检测ISRE-Luc活性 UBR5敲除验证：使用gRNA #1、#2、#3构建UBR5−/−细胞，检测ISRE-Luc活性、分泌IFN-β和IFNB1 mRNA 体内验证：Ubr5iKO小鼠（ERT2-Cre+/−Ubr5flox/flox，他莫昔芬1 mg隔日共5次）感染EMCV或VSV，检测生存率、病毒载量和细胞因子 机制验证：UBR5介导TRIM28 K63连接泛素化，K507为泛素化位点，抑制TRIM28 SUMO化及启动子结合
摘要
视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）是启动抗病毒免疫应答的主要病毒RNA传感器。RLRs受到严格的转录和翻译后调控，其中泛素化是最重要的调控方式之一。然而，泛素化在RLR转录中的作用尚不清楚。在这里，我们筛选了375个确定的泛素连接酶敲除细胞系，并鉴定出泛素蛋白连接酶E3组分N-识别素5（UBR5）是RLR转录的正调控因子。UBR5缺失会降低对RNA病毒的抗病毒免疫应答，同时增加原代细胞和小鼠中的病毒复制。Ubr5敲除小鼠比野生型同窝小鼠更容易受到致死性RNA病毒感染。机制上，UBR5介导三联基序蛋白28（TRIM28）的赖氨酸63连接泛素化，TRIM28是RLRs的表观遗传抑制因子。这种修饰阻止TRIM28的分子内SUMO化，从而解除TRIM28对RLR转录施加的刹车。总之，UBR5通过泛素化和去SUMO化TRIM28，使RLR表达快速上调，从而增强抗病毒免疫应答。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 泛素化是否以及如何调控RLR转录，从而影响抗病毒免疫应答？
- 核心机制
- UBR5介导TRIM28的K63连接泛素化，阻止TRIM28分子内SUMO化，从而解除TRIM28对RLR启动子的表观遗传抑制，促进RLR转录。
- 主要证据
- 通过375个E3敲除细胞系筛选鉴定UBR5；UBR5缺失降低RLR表达和IFN应答并增加RNA病毒复制；Ubr5iKO小鼠对EMCV和VSV更易感；UBR5与TRIM28互作，介导TRIM28 K507 K63泛素化并抑制其SUMO化及启动子结合。
- 研究意义
- 揭示了UBR5-TRIM28轴通过泛素化-去SUMO化精细调控RLR转录的机制，为病毒控制提供了新的干预靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选RLR通路调控因子
鉴定调控RLR-MDA5、cGAS-STING及JAK-STAT1/2通路的E3连接酶。
用poly(I:C)、ISD或IFN-β刺激E3敲除文库，检测ISRE-Luc活性。
验证UBR5在RLR信号和抗病毒免疫中的功能
确认UBR5对RLR信号及RNA病毒复制的调控作用。
构建独立UBR5敲除细胞系，检测ISRE-Luc活性、IFN-β分泌和IFNB1 mRNA；在MEF和BMDM中诱导Ubr5敲除；检测EMCV、VSV和SARS-CoV-2复制。
体内验证UBR5对RNA病毒感染的调控
评估UBR5缺失对小鼠RNA病毒感染致病性的影响。
使用Ubr5iKO小鼠感染EMCV或VSV，监测生存率、病毒载量和细胞因子水平。
解析UBR5调控RLR转录的机制
确定UBR5是否通过TRIM28调控RLR转录及其泛素化/SUMO化修饰。
通过Co-IP、IP-MS/MS、ChIP-qPCR和ChIP-seq验证UBR5与TRIM28互作、TRIM28泛素化位点和启动子结合。
全转录组分析UBR5和TRIM28共同靶基因
确定UBR5-TRIM28轴在PRR-IFN信号中调控的基因网络。
对WT、UBR5−/−和TRIM28−/− HEK293T细胞进行RNA-seq，比较poly(I:C)或IFN-β处理后的差异表达基因。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | Proteintech Group, Inc | 60004-1-Ig |
| 抗TRIM28抗体 | BioLegend | 619302 | |
| 抗UBR5抗体 | Bethyl Laboratories, Inc | A300-573A | |
| MG132 | Cell Signaling Technology | 2194 | |
| 抗K63连接多聚泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 5621 | |
| 抗K48连接多聚泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 12805 | |
| 抗SUMO-1抗体 | Cell Signaling Technology | 4930 | |
| 抗SUMO-2/3抗体 | Cell Signaling Technology | 4971 | |
| 抗RIG-I抗体 | Cell Signaling Technology | 3743 | |
| 抗MDA5抗体 | Cell Signaling Technology | 5321 | |
| 抗MAVS抗体 | Cell Signaling Technology | 24930 | |
| 抗IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 11904 | |
| 抗STING抗体 | Cell Signaling Technology | 13647 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804-200UG | |
| 抗VSV-G抗体 | Sigma-Aldrich | V4888 | |
| 辣根过氧化物酶标记抗兔IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 细胞培养与转染 | TransIT-X2动态递送系统 | Mirus Bio LLC | MIR6005 |
| RLR刺激 | 干扰素刺激DNA | Invivogen | tlrl-isdn |
| 5’三磷酸发夹RNA | Invivogen | tlrl-hprna | |
| 高分子量聚肌苷酸-聚胞苷酸 | Invivogen | tlrl-pic | |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG M2磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 |
| 抗Myc磁珠 | Thermo Fisher | 88842 | |
| 免疫荧光 | 驴抗小鼠Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher | A32766 |
| 山羊抗兔Alexa Fluor Plus 594 | Thermo Fisher | A32740 | |
| DAPI溶液 | Thermo Fisher | 62248 | |
| ELISA | 重组人IFN-β | R&D system, Inc | 8499-IF |
| 人IFN-β DuoSet ELISA试剂盒 | R&D system, Inc | DY814-05 | |
| 生物发光小鼠IFN-β ELISA试剂盒2.0 | InvivoGen | luex-mifnbv2 | |
| 小鼠IFN-α ELISA试剂盒 | Invitrogen | BMS6027 | |
| LEGENDplex磁珠多重ELISA试剂盒 | Biolegend | -- | |
| 定点突变 | QuikChange II定点突变试剂盒 | Agilent Technologies, Inc | 200523 |
| CRISPR编辑检测 | Alt-R基因组编辑检测试剂盒 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 1075932 |
| 荧光素酶检测 | 荧光素酶检测试剂盒 | Promega Corporation | E1501 |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega Corporation | E1910 | |
| 报告基因裂解缓冲液 | Promega Corporation | E397A | |
| ChIP | ChIP-IT Express酶切打断试剂盒 | ActiveMotif | 53035 |
| ChIP检测试剂盒 | Millipore-Sigma | 17-295 | |
| ChIP DNA纯化浓缩试剂盒 | ZYMO research | D5205 | |
| RNA提取与逆转录 | RNApure组织与细胞RNA提取试剂盒 | CoWin Biosciences | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript逆转录试剂盒 | TaKaRa Bio, Inc | RR037A |
| iTaq通用SYBR Green预混液 | BioRad | 1725124 | |
| 基因组DNA提取 | PureLink基因组DNA小量提取试剂盒 | Thermo Fisher | K182002 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| E3敲除文库筛选 | poly(I:C) 1 µg/mL转染12 h、ISD 0.4 µg/mL转染12 h、IFN-β 1 ng/mL处理12 h；每批约20个敲除系，设WT及STING−/−、MAVS−/−、IFNAR1−/−对照；n=3生物学独立实验 阅读提示：Methods中E3 knockout library screening小节及Fig. 1图注 |
| UBR5敲除细胞验证 | UBR5 gRNA #1、#2、#3敲除效率；poly(I:C)转染12 h；检测ISRE-Luc、分泌IFN-β和IFNB1 mRNA；n=3生物学独立实验 阅读提示：Fig. 2图注及Methods中Generation of knockout cells by CRISPR-Cas9小节 |
| 小鼠Ubr5诱导性敲除 | ERT2-Cre+/−Ubr5flox/flox小鼠，8周龄，他莫昔芬1 mg隔日共5次（溶于玉米油），末次给药后清除两周；对照为玉米油处理的同窝小鼠 阅读提示：Methods中Mouse model小节 |
| 小鼠病毒感染 | EMCV 100或1,000 PFU腹腔注射，或1×10^7 PFU静脉注射；VSV 1×10^6 PFU眶后注射；生存监测15-20天，每天两次；疾病评分0-5分 阅读提示：Methods中Viral infection in mice小节及Fig. 4图注 |
| TRIM28泛素化与SUMO化检测 | FLAG-TRIM28、HA-K63Ub或HA-K48Ub、His-UBC9和HA/Myc-SUMO质粒转染24 h；poly(I:C)处理12 h；VSV MOI=0.5感染；K507R和K779R突变体 阅读提示：Fig. 7图注及Methods中Plasmids和Site-directed mutagenesis of TRIM28小节 |