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        非经典Rb失活途径与外部信号协调不依赖CDK4/6活性的细胞周期进入

        Non-canonical pathway for Rb inactivation and external signaling coordinate cell-cycle entry without CDK4/6 activity.

        作者信息Mimi Zhang, Sungsoo Kim, Hee Won Yang
        PMID38030655
        期刊Nat Commun
        发布时间2023-11-29
        DOI10.1038/s41467-023-43716-y
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        多细胞系体外模型，结合活细胞成像、敲除/过表达、蛋白稳定性分析及癌症细胞适应实验，含功能与机制验证。

        主要模型

        MCF-10A人乳腺上皮细胞 RPE1人视网膜色素上皮细胞 HS68人成纤维细胞 癌症细胞系（MP41/MP46葡萄膜黑色素瘤、H1373/H358非小细胞肺癌、WM983B/WM989黑色素瘤） OP-9/PC-12/PLB-985分化细胞模型

        重点核对

        CDK4/6抑制方法：palbociclib（1µM）、接触抑制、trametinib（10nM）、p16过表达（TMP 50µM）处理48小时 Rb蛋白与mRNA水平检测：免疫印迹与RT-qPCR，n≥2生物学重复 活细胞成像：CDK2/CDK4/6活性报告系统，Cdt1降解子细胞周期指示，每12分钟成像 c-Myc诱导/敲低：多西环素诱导系统（5µM）或siRNA（20nM） EdU/EU掺入实验：EdU（10µM）或EU（1mM）处理15分钟至48小时检测S期或转录

        摘要

        细胞周期蛋白依赖性激酶4和6（CDK4/6）通过失活视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）启动细胞增殖。然而，哺乳动物细胞可不依赖CDK4/6使Rb失活。本文展示了一条非经典Rb失活途径及其与外部信号的相互作用。我们发现，静止细胞中未磷酸化的Rb蛋白本质上不稳定，为启动E2F活性提供了替代机制。然而，该途径不完全诱导Rb蛋白丢失，导致E2F活性极低。为触发细胞增殖，需要上调促有丝分裂信号以稳定c-Myc，从而增强E2F活性。同时，应激信号促进Cip/Kip水平，与促有丝分裂信号竞争性调节细胞增殖。在癌症中，驱动突变升高c-Myc水平，促进对CDK4/6抑制剂的适应。分化细胞尽管Rb蛋白丢失，仍通过调节c-Myc和Cip/Kip水平维持静止。我们的发现为细胞周期进入的替代模型和静止维持提供了机制见解。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        哺乳动物细胞如何在不依赖CDK4/6活性情况下使Rb失活并进入细胞周期，以及外部信号如何协调该过程。
        核心机制
        非磷酸化Rb蛋白在静止细胞中不稳定导致其水平降低，但仅引起微弱E2F活性；促有丝分裂信号通过稳定c-Myc增强E2F活性，而应激信号通过上调Cip/Kip（p21/p27）竞争性抑制CDK2活性，三者顺序协调不依赖CDK4/6的细胞周期进入。
        主要证据
        在MCF-10A、RPE1、HS68及多种癌细胞系中，CDK4/6抑制导致Rb蛋白降低但E2F活性低；c-Myc诱导可增强E2F活性和S期进入；p21/p27三敲除或p27诱导实验证明Cip/Kip的调控作用；活细胞成像显示CDK2激活顺序。
        研究意义
        揭示了不依赖CDK4/6的细胞周期进入替代模型，为理解静止维持和癌症对CDK4/6抑制剂适应提供机制见解，提示靶向促有丝分裂信号联合CDK4/6抑制可能减少耐药持久细胞。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        建立CDK4/6抑制模型并检测Rb蛋白变化

        验证CDK4/6抑制是否降低Rb蛋白水平及其可逆性。

        使用palbociclib、接触抑制、trametinib或p16过表达处理MCF-10A、RPE1、HS68细胞48小时，免疫印迹检测Rb蛋白，RT-qPCR检测Rb mRNA；释放后检测Rb蛋白恢复。

        2

        证明非磷酸化Rb在静止细胞中不稳定

        确定Rb蛋白减少是否由于非磷酸化Rb的内在不稳定性。

        建立YFP-Rb稳定表达细胞，活细胞成像追踪单细胞Rb水平与CDK2活性；使用cycloheximide（10µg/ml）测定Rb半衰期；比较野生型与磷酸化模拟突变体Rb稳定性。

        3

        检测Rb蛋白减少对E2F活性的影响

        验证单独Rb蛋白减少是否足以有效激活E2F和细胞周期进入。

        CDK4/6抑制后监测Rb蛋白和E2F靶基因mRNA水平；使用CDK4/6、CDK2活性报告系统和Cdt1降解子活细胞成像追踪细胞周期进入。

        4

        验证c-Myc对E2F活性的增强作用

        确定c-Myc在Rb蛋白减少后增强E2F活性并促进CDK4/6非依赖细胞周期进入。

        c-Myc敲低或诱导后检测全局转录率（EU掺入）、Rb磷酸化、E2F靶基因和S期细胞；结合CDK4/6i和MEKi处理。

        5

        研究Cip/Kip家族对CDK4/6非依赖增殖的调控

        验证p21/p27/p57在CDK4/6非依赖细胞周期进入中的作用及与促有丝分裂信号的竞争。

        使用p21/p27/p57三敲除MCF-10A细胞，结合CDK4/6i和EdU掺入；诱导p27表达；在耐药细胞中滴定促有丝分裂信号和DNA损伤剂NCS。

        6

        评估癌细胞对CDK4/6抑制剂的适应及联合靶向

        检验促有丝分裂信号上调是否促进癌细胞对CDK4/6i适应，以及联合靶向能否抑制持久细胞。

        比较非转化细胞与葡萄膜黑色素瘤细胞在CDK4/6i下的持久细胞比例；使用sotorasib、vemurafenib、trametinib靶向促有丝分裂信号，检测p-ERK、c-Myc、EU掺入和EdU掺入。

        7

        研究分化细胞中静止的维持

        验证分化细胞尽管Rb蛋白丢失，仍通过调节c-Myc和Cip/Kip维持静止。

        使用PLB-985、PC-12、OP-9分化模型，检测Rb、c-Myc、p21/p27表达和S期比例；在分化OP-9中诱导c-Myc并联合CDK4/6i检测S期进入。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        免疫荧光RNA荧光原位杂交活细胞成像
        验证细胞功能变化
        EdU掺入实验EU掺入实验CDK活性活细胞报告基因检测
        验证分子表达变化
        免疫印迹实时定量PCR
        验证机制链路
        放线菌酮追踪实验多西环素诱导基因表达siRNA敲低DHFR-TMP蛋白稳定系统
        数据分析与统计
        单因素方差分析双尾非配对t检验Kaplan-Meier生存分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养DMEM/F12培养基Gibco11039047
        马血清Gibco16050122
        表皮生长因子PeprotechHZ-1326
        胰岛素SigmaI1882
        氢化可的松SigmaH0888
        霍乱毒素SigmaC8052
        胎牛血清Gibco10437028
        潮霉素BInvivoGenant-hg
        DMEM培养基Genesee Scientific25-500
        RPMI-1640培养基Genesee Scientific25-506
        MCDB153培养基SigmaM7403
        Leibovitz's L15培养基Gibco21083027
        MEM-α培养基Gibco12571048
        胶原蛋白Advanced BioMatrix5005-B
        多聚-D-赖氨酸SigmaA-003-E
        药物处理帕博西尼Selleck ChemicalsS1116
        曲美替尼Selleck ChemicalsS2673
        维莫非尼Selleck ChemicalsS1267
        索托拉西布MedChemExpressHY-114277
        多西环素SigmaD9891
        甲氧苄啶Cayman Chemical16473
        新制癌菌素SigmaN9162
        EdU/EU掺入5-乙炔基-2'-脱氧尿苷Sigma900584
        5-乙炔基尿苷Click Chemistry Tools1261
        免疫荧光磷酸化Rb (Ser807/811)抗体Cell Signaling Technology8516
        免疫荧光/免疫印迹Rb抗体Cell Signaling Technology9309
        免疫荧光c-Myc抗体Cell Signaling Technology5605
        免疫印迹磷酸化ERK1/2 (Thr202/Tyr204)抗体Cell Signaling Technology4370
        ERK1/2抗体Cell Signaling Technology4696
        磷酸化AKT (Ser473)抗体Cell Signaling Technology4060
        AKT抗体Cell Signaling Technology2920
        免疫荧光/免疫印迹PPARγ抗体Cell Signaling Technology2435
        免疫印迹p21抗体Cell Signaling Technology2947
        免疫荧光/免疫印迹p27抗体Cell Signaling Technology3686
        免疫荧光p57抗体Cell Signaling Technology2557
        免疫印迹GAPDH抗体Cell Signaling Technology2118
        细胞周期蛋白D1抗体Thermo ScientificMA5-14512
        FPR1抗体BioLegend391602
        SYN1抗体ABclonalA17362
        Rb抗体Abcamab181616
        c-Myc抗体Abcamab32072
        免疫荧光p21抗体BD Biosciences556430
        免疫印迹p27抗体BD Biosciences610241
        p21抗体Santa Cruz Biotechnologysc-271610
        免疫荧光Alexa Fluor 488山羊抗兔Thermo ScientificA32731
        Alexa Fluor 568山羊抗兔Thermo ScientificA11036
        Alexa Fluor 488山羊抗小鼠Thermo ScientificA32723
        Alexa Fluor 568山羊抗小鼠Thermo ScientificA11031
        免疫印迹辣根过氧化物酶标记抗兔抗体Cell Signaling Technology7074
        IRDye 800CW山羊抗小鼠LI-COR Biosciences926-32210
        IRDye 680RD山羊抗兔LI-COR Biosciences926-68071
        siRNA转染DharmaFECT1转染试剂HorizonT-2001
        RT-qPCRGeneJET RNA纯化试剂盒Thermo ScientificK0731
        qScript cDNA合成预混液VWR101414-106
        PerfeCTa SYBR Green FastMixVWR101414-286
        QuantStudio 6 Flex实时PCR系统Applied Biosystems4485691
        免疫印迹CHAPS裂解缓冲液----
        Halt蛋白酶抑制剂混合物Thermo Scientific1861279
        磷酸酶抑制剂Sigma4906845001
        RIPA裂解缓冲液SigmaR0278
        Pierce 660 nm蛋白检测试剂Thermo Scientific22660
        LDS上样缓冲液InvitrogenNP0007
        4-12% Bis-Tris凝胶Invitrogen--
        Trans-Blot Turbo转印系统Bio-Rad1704150
        封闭液LI-COR927-60001
        剥离缓冲液Thermo Scientific46430
        免疫荧光96孔玻璃底板CellvisP96-1.5P
        Click-IT EdU/EU检测试剂盒（含AFDye 647吡啶甲基叠氮）Click Chemistry Tools1300
        Hoechst 33342染料Thermo Scientific62249
        RNA FISHViewRNA ISH细胞检测试剂盒Thermo ScientificQVC0001
        细胞分化二甲基亚砜SigmaD2438
        大鼠β-神经生长因子R&D System556NG100
        Knockout血清Gibco10828028

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        CDK4/6抑制处理
        palbociclib浓度（1µM）、trametinib浓度（10nM或100nM）、处理时间（48小时或24小时）
        阅读提示：Methods中“Drugs and chemicals”及图注Fig. 1b–e、Fig. 4f
        Rb蛋白稳定性检测
        cycloheximide浓度（10µg/ml）、palbociclib预处理时间（24小时）、成像追踪细胞数
        阅读提示：图注Fig. 2f、g及Methods中“Drugs and chemicals”
        活细胞成像报告系统
        CDK2/CDK4/6报告构建体、Cdt1降解子、成像间隔（12分钟）、CDK2活性阈值（>1持续2小时）
        阅读提示：Methods中“Live-cell reporters”及图注Fig. 3d、e
        c-Myc诱导或敲低
        多西环素浓度（5µM）、siRNA浓度（20nM）、处理时间（48小时或24小时）
        阅读提示：Methods中“siRNA transfection”及图注Fig. 4e–j
        EdU/EU掺入检测
        EdU浓度（10µM）、EU浓度（1mM）、掺入时间（15分钟至48小时或72小时）
        阅读提示：Methods中“Immunofluorescence”及图注Fig. 5f、g、Fig. 6e、Fig. 7e
        Cip/Kip调控实验
        p21/p27/p57三敲除细胞、p27诱导（DHFR-TMP系统，TMP浓度文中未明确说明）、palbociclib预处理24小时
        阅读提示：图注Fig. 5b–d及Methods中“Cell line generation”
        癌细胞适应实验
        细胞系（MP41、MP46、H1373、H358、WM983B、WM989）、药物浓度（sotorasib 1µM、vemurafenib 1µM、trametinib 10nM）、EdU掺入48小时
        阅读提示：图注Fig. 6c–g及Methods中“Cell culture”
        分化细胞模型
        分化诱导条件（PLB-985：1.3% DMSO；PC-12：50ng/mL beta-NGF；OP-9：15% Knockout Serum）、分化时间（6天）、c-Myc诱导（5µM多西环素）
        阅读提示：Methods中“Cell differentiation”及图注Fig. 7a–e

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