NAFLD/NASH中Usp39表达下调及肝细胞特异性敲除小鼠构建
验证Usp39在NAFLD/NASH中的表达变化并建立肝细胞特异性敲除模型
分析GEO数据库及人类NAFLD队列中Usp39表达；检测HFD/MCD小鼠和NASH患者肝组织Usp39蛋白水平；构建Usp39fl/fl;Alb-Cre小鼠。
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剪接体组分Usp39通过调控自噬参与肝脏脂质稳态
Spliceosome component Usp39 contributes to hepatic lipid homeostasis through the regulation of autophagy.
实验完整度
高包含肝细胞特异性敲除小鼠、HFD/MCD饮食模型、AML12细胞和原代肝细胞、人类NASH肝样本，并进行RIP-seq/RNA-seq、剪接验证及Hsf1回补功能验证。
主要模型
肝细胞特异性Usp39敲除小鼠（Usp39-HKO） AML12小鼠肝细胞系 原代小鼠肝细胞 人类NASH肝组织样本
重点核对
Usp39-HKO小鼠在5周龄、10周龄和12月龄的表型及HFD 12周、MCD 5周模型 AML12细胞和原代肝细胞中Usp39敲低/过表达及Hsf1回补实验 RIP-seq和RNA-seq联合分析鉴定Usp39结合靶基因及AS事件 Hsf1第6外显子A5SS剪接及NMD降解验证（放线菌素D实验、Upf1敲低） AAV8-TBG-Cre联合Ad-Hsf1体内回补实验
摘要
选择性剪接（AS）调控使单个转录本产生多种异构体，增加转录组和蛋白质组多样性。本文报道剪接体组分Usp39在肝细胞脂质稳态调控中发挥作用。我们证明Usp39表达在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）受试者肝组织中下调。小鼠肝细胞特异性敲除Usp39导致脂质积累增加、自发性脂肪变性和自噬受损。RNA免疫沉淀（RIP-seq）和bulk RNA测序（RNA-seq）数据的联合分析揭示Usp39调控多个自噬相关基因的AS。特别是，Usp39缺失导致热休克转录因子1（Hsf1）第6外显子的选择性5‘剪接位点选择，并因此降低其表达。重要的是，过表达Hsf1可减轻Usp39缺失引起的脂质积累。综上所述，我们的发现表明Usp39介导的AS是维持肝脏自噬和脂质稳态所必需的。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 剪接体组分Usp39在肝脏脂质稳态中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- Usp39通过调控自噬相关基因（包括Hsf1）的选择性剪接维持自噬；Usp39缺失导致Hsf1第6外显子A5SS剪接产生PTC异构体并经NMD降解，Hsf1下调进而损害自噬，引起肝细胞脂质积累。
- 主要证据
- Usp39-HKO小鼠出现自发性脂肪变性、自噬受损；RIP-seq和RNA-seq鉴定Usp39结合并调控Hsf1剪接；Hsf1过表达可减轻Usp39缺失引起的脂质积累和自噬缺陷。
- 研究意义
- 揭示Usp39介导的选择性剪接是维持肝脏自噬和脂质稳态所必需的，提示其可能作为治疗脂肪性肝病的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肝细胞特异性Usp39敲除对肝脏稳态和自发性脂肪变性的影响
明确Usp39缺失是否引起肝脏损伤和自发性脂肪变性
检测5周龄、10周龄和12月龄Usp39-HKO小鼠的体重、肝重、肝功能、组织学及脂质含量；分析HFD和MCD饮食模型下的脂肪变性程度。
Usp39缺失对自噬的影响及脂质代谢途径分析
探究Usp39缺失导致脂质积累的机制是否涉及自噬抑制
检测自噬相关基因和蛋白表达、自噬体形成、LC3 puncta与脂滴共定位；分析脂质合成、脂解和脂肪酸氧化相关基因表达；Seahorse检测OCR。
Usp39调控自噬相关基因选择性剪接的鉴定
鉴定Usp39直接结合并调控剪接的靶基因
对Usp39-HKO小鼠肝脏进行RNA-seq，rMATS分析AS事件；在AML12细胞中进行RIP-seq，鉴定Usp39结合位点和motif；联合分析筛选候选靶基因，RT-PCR验证AS事件。
Usp39缺失导致Hsf1错误剪接和NMD降解的验证
验证Usp39缺失导致Hsf1第6外显子A5SS剪接及NMD降解
分析Hsf1剪接事件，RT-PCR验证PSI；minigene剪接实验；qPCR检测Hsf1-FL和Hsf1-NMD异构体；放线菌素D实验检测RNA半衰期；RIP-qPCR和RNA pull-down验证Usp39与Hsf1结合。
Hsf1回补挽救Usp39缺失引起的脂质积累和自噬缺陷
验证Hsf1下调介导Usp39缺失导致的肝脂肪变性
在AML12细胞中过表达Hsf1或敲低Hsf1，检测脂滴和自噬标志；在Usp39-HKO小鼠中通过AAV8-TBG-Cre联合Ad-Hsf1进行体内回补，检测肝脏脂质和自噬。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 60% kcal高脂饲料 | Research Diets | D12492 |
| MCD饲料 | Biotechnology | XSYT-ED-009 | |
| 细胞培养 | ITS液体培养基添加剂 | Sigma | -- |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 原代肝细胞分离 | IV型胶原酶 | -- | -- |
| 原代肝细胞培养 | T4甲状腺激素 | -- | -- |
| 胰岛素 | Macgene | CC101 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596-026 |
| RT-qPCR | HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 |
| ChamQ SYBR Colour qPCR Master Mix | Vazyme | Q411-02 | |
| 免疫组化 | 兔抗Usp39抗体 | Abcam | ab131332 |
| Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| Pcna抗体 | Servicebio | GB11010-1 | |
| F4/80抗体 | Servicebio | GB11027 | |
| 免疫荧光 | 兔抗Usp39抗体 | Abcam | ab131244 |
| Sox9抗体 | Millipore | AB5535 | |
| 白蛋白抗体 | Proteintech | 16475-1-AP | |
| Perilipin 2抗体 | Proteintech | 15294-1-AP | |
| 大鼠抗Lamp2抗体 | Abcam | ab13524 | |
| 小鼠抗SC35抗体 | Abcam | ab11826 | |
| 油红O染色 | 油红O溶液 | Merck | O625 |
| 血清检测 | ALT/AST/白蛋白/LDH检测试剂盒 | Sigma | -- |
| 血清TG检测 | 甘油三酯检测试剂盒 | -- | -- |
| 肝脏TG/NEFA检测 | 比色法检测试剂盒 | -- | -- |
| RIP-seq | Magna NuCLEAR™ RIP（交联）核RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | -- | 17-10520 |
| Minute™细胞质和细胞核提取试剂盒 | Invent | -- | |
| 抗FLAG磁珠 | MBL | M185-11 | |
| 离心柱RNA纯化浓缩试剂盒 | Sangon | -- | |
| NEB Next Ultra RNA文库构建试剂盒（Illumina） | NEB | -- | |
| 脂质组学 | CSH C18色谱柱 | Waters | -- |
| 免疫印迹 | 增强型BCA蛋白检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 兔抗Usp39抗体 | Abcam | ab131244 | |
| LC3A/B (D3U4C) XP抗体 | Cell Signaling Technology | 12741 | |
| SQSTM1/p62抗体 | Cell Signaling Technology | 5114 | |
| Atg7抗体 | Cell Signaling Technology | 8558 | |
| Ulk1抗体 | Abways | CY6902 | |
| Hsf1抗体 | Proteintech | 51034-1-AP | |
| Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| Cleaved Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| Lamin B1抗体 | Proteintech | 12987-1-AP | |
| Gapdh抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Usp39抗体 | Abcam | ab131332 | |
| Usp39 N端抗体 | Abcam | ab236453 | |
| Usp39抗体 | Invitrogen | A304-816A | |
| 小鼠Actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| HRP标记二抗 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| Pierce ECL底物 | Vazyme | E412-02 | |
| RNA pull-down | RNAMAX-T7体外转录试剂盒 | RiboBio | -- |
| Pierce™ RNA 3‘端脱硫生物素标记试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 磁珠RNA-蛋白pull-down试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肝细胞特异性Usp39敲除小鼠构建与表型 | 小鼠品系背景（C57BL/6J）、Cre品系（Albumin-Cre）、敲除策略（flank exon 2）、周龄（5周、10周、12月龄）、性别（雄性）、禁食时间（16h） 阅读提示：Methods-Mice及图2、图3图注 |
| 饮食诱导模型 | HFD配方（D12492，60% kcal fat）、喂养起始周龄（4周）和持续时间（12周）；MCD饲料（XSYT-ED-009）、喂养起始周龄（10周）和持续时间（5周） 阅读提示：Methods-Mice及图3图注 |
| 细胞实验（AML12和原代肝细胞） | 细胞系来源（ATCC）、培养基（DMEM-F12+ITS+地塞米松）、油酸浓度（0.4 mM）和处理时间（6h或12h）、转染试剂用量（质粒1μg或siRNA 50nM）及时间（48或72h） 阅读提示：Methods-Cell lines and constructs及图4、图7图注 |
| RIP-seq和RNA-seq | RIP-seq交联条件（甲醛5min）、超声条件（Bioruptor Pico 10 cycles）、抗体（anti-FLAG磁珠M185-11）；RNA-seq禁食时间（16h）、测序平台（NovaSeq 6000）和分析软件（rMATS、DESeq2） 阅读提示：Methods-RNA-seq, RIP-seq, and bioinformatics |
| Hsf1回补体内实验 | AAV8-TBG-Cre和Ad-Hsf1注射周龄（8周）、病毒剂量（文中未明确说明）、饮食（正常饮食4周）、取材前禁食时间（16h） 阅读提示：Methods-Mice及图7图注 |