snRNA-seq鉴定ECs与BAs间配体-受体互作
寻找BAT中ECs与BAs间可能介导串扰的信号通路。
对成年C57BL/6J小鼠BAT消化后漂浮层（BAs和碎片化血管）分离的细胞核进行snRNA-seq，聚类并利用CellChat分析配体-受体配对。
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内皮细胞来源的干细胞因子通过c-Kit介导的棕色脂肪细胞脂肪生成酶增加促进脂质积累
Endothelial cell-derived stem cell factor promotes lipid accumulation through c-Kit-mediated increase of lipogenic enzymes in brown adipocytes.
实验完整度
高包含snRNA-seq、体外细胞过表达与抑制剂实验、BA特异性及EC特异性基因敲除小鼠模型，并有功能与机制验证。
主要模型
C57BL/6J小鼠棕色脂肪组织 永生化棕色脂肪前体细胞系 BA特异性c-Kit敲除小鼠（c-Kit∆BA） EC特异性SCF敲除小鼠（SCFiΔEC）
重点核对
c-KitiTR报告小鼠中c-Kit+ BAs数量及c-Kit蛋白水平变化 c-Kit过表达BA中SCF处理后的pAKT、pERK及SCD1等蛋白水平 c-Kit∆BA小鼠在单侧去神经支配或热中性条件下的脂肪生成酶及脂滴大小 SCFiΔEC小鼠在热中性条件下的c-Kit蛋白、脂肪生成酶及脂滴大小 UPLC-QTOF-MS检测BAT中游离脂肪酸比例及SCD1去饱和指数
摘要
棕色脂肪组织（BAT）中活跃的产热作用促进脂质和葡萄糖的利用，对于维持体温和减少代谢性疾病至关重要，而不活跃的BAT会在棕色脂肪细胞（BAs）中积累脂质，导致BAT白化。尽管内皮细胞（ECs）与脂肪细胞之间的细胞串扰对于BAs中脂肪酸的转运和利用至关重要，但ECs介导这种串扰的血管分泌作用仍知之甚少。利用单核RNA测序和敲除雄性小鼠，我们证明ECs来源的干细胞因子（SCF）通过激活BAs中的c-Kit，上调从头脂肪生成酶的基因表达和蛋白水平，并促进脂质积累。在去神经支配或热中性诱导的脂质积累早期阶段，BAs上瞬时表达的c-Kit通过PI3K和AKT信号增加脂肪生成酶的蛋白水平。在雄性小鼠中，EC特异性SCF缺失和BA特异性c-Kit缺失减弱了去神经支配或热中性后脂肪生成酶的诱导，并抑制了BAs中脂滴的增大。这些数据提供了对SCF/c-Kit信号作为调节因子的见解，该信号在产热受到抑制时通过增加BAT中的脂肪生成酶来促进脂质积累。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 内皮细胞来源的SCF是否通过c-Kit调控棕色脂肪细胞中的脂肪生成酶及脂质积累。
- 核心机制
- EC来源的SCF激活BAs上的c-Kit，通过PI3K和AKT信号通路上调脂肪生成酶（尤其是SCD1）的蛋白水平，从而促进脂滴增大和脂质积累。
- 主要证据
- snRNA-seq显示ECs与BAs间Kitl-Kit配体-受体互作；体外SCF处理c-Kit过表达BAs增加pAKT、pERK及ACL、ACC、SCD1蛋白；c-Kit∆BA和SCFiΔEC小鼠在去神经或热中性后脂肪生成酶降低、脂滴增大受抑。
- 研究意义
- 提示SCF/c-Kit信号是产热抑制时通过增加脂肪生成酶促进BAT脂质积累的调节通路，可能为预防BAT白化提供思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SCF和c-Kit表达定位验证
验证SCF在ECs中的表达及c-Kit在BAs中的选择性表达。
使用SCF-GFP报告小鼠和c-KitiTR报告小鼠，通过免疫荧光染色检测SCF与CD31、F4/80的共定位及c-Kit+细胞在BAT、WAT等组织中的分布。
产热激活对c-Kit+ BAs的影响
检测增强产热是否改变BAT中c-Kit+ BAs数量及c-Kit蛋白水平。
将c-KitiTR小鼠或C57BL/6J小鼠暴露于冷环境（7°C）或给予β3-AR激动剂CL316,247，检测c-Kit+ BAs数量及c-Kit、UCP1蛋白水平。
去神经支配模型诱导脂质积累
研究产热抑制时c-Kit+ BAs数量、c-Kit蛋白及脂滴大小的变化。
对8周龄小鼠进行BAT单侧去神经支配（左侧肋间神经切断，右侧作为内对照），在术后第3或第5天分离I-BAT和D-BAT，检测TH、c-Kit、UCP1蛋白及脂滴大小。
体外验证SCF/c-Kit对脂肪生成酶的调控及信号通路
验证c-Kit激活是否通过特定信号通路上调脂肪生成酶并促进脂质积累。
在永生化的棕色脂肪前体细胞中过表达c-Kit并诱导分化，用SCF或BSA处理，检测pAKT、pERK及ACL、ACC、FASN、SCD1蛋白；使用多种信号抑制剂预处理后检测SCD1；用LipidTOX检测脂质积累。
BA特异性c-Kit敲除验证去神经及热中性下的功能
验证BAs中c-Kit对去神经支配或热中性诱导的脂肪生成酶增加及脂滴增大的作用。
构建c-Kit∆BA小鼠（UCP1-Cre × c-Kitflox/flox），在单侧去神经支配或热中性（30°C）条件下检测脂肪生成酶蛋白水平及脂滴大小分布。
EC特异性SCF敲除验证配体来源
验证ECs来源的SCF在热中性条件下对c-Kit及脂肪生成酶的调控。
构建SCFiΔEC小鼠（VE-cadherin-Cre-ERT2 × SCFflox/flox），热中性适应3或5天后检测BAT中c-Kit、ACL、ACC、FASN、SCD1蛋白水平、游离脂肪酸比例及脂滴大小。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| BAT消化 | II型胶原酶 | Worthington | LS004177 |
| 中性蛋白酶 | Gibco | 17105041 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T4799 | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco | 26140079 |
| 核分离 | Nuclei EZ裂解缓冲液 | Sigma-Aldrich | NUC-101 |
| Vybrant DyeCycle染料 | Thermo Fisher Scientific | V35004 | |
| 单核RNA测序 | BD Rhapsody全转录组扩增试剂盒 | BD Biosciences | 633802 |
| 免疫荧光染色 | 抗CD31抗体 | Millipore | MAB1398Z |
| 抗GFP抗体 | Abcam | ab6658 | |
| 抗F4/80抗体 | Bio-Rad | MCA497G | |
| PE偶联CD147抗体 | BioLegend | 123707 | |
| 脂滴染色 | BODIPY 493/503脂滴染料 | Invitrogen | D3922 |
| LipidTOX红色脂滴染料 | Invitrogen | H34476 | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解缓冲液 | LPS solution | CBR002 |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | CST | 5872 | |
| Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| 抗c-Kit抗体 | CST | 3074 | |
| 抗ACC抗体 | CST | 3676 | |
| 抗FASN抗体 | CST | 3180 | |
| 抗SCD1抗体 | CST | 2794 | |
| 抗GAPDH抗体 | CST | 5174 | |
| 抗磷酸化AKT1 (Ser473)抗体 | CST | 9018 | |
| 抗AKT1抗体 | CST | 2938 | |
| 抗磷酸化AKT2 (Ser474)抗体 | CST | 8599 | |
| 抗AKT2抗体 | CST | 3063 | |
| 抗磷酸化p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204)抗体 | CST | 4377 | |
| 抗p44/42 MAPK抗体 | CST | 4695 | |
| 抗PGC1-α抗体 | Abcam | ab191838 | |
| 抗酪氨酸羟化酶抗体 | Abcam | ab137869 | |
| 抗ACL抗体 | Abcam | ab40793 | |
| 抗UCP1抗体 | Abcam | ab23841 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Santacruz | sc-69970 | |
| 抗兔二抗 | CST | 7074 | |
| 抗小鼠二抗 | CST | 7076 | |
| ECL蛋白质印迹检测液 | Millipore | WBKLS0500 | |
| 细胞培养 | 小鼠c-Kit cDNA | OriGene | MR227469 |
| FUGW慢病毒质粒 | Addgene | 14883 | |
| 细胞分化 | 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I5523 |
| 三碘甲状腺原氨酸 | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 异丁基甲基黄嘌呤 | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| 吲哚美辛 | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| 细胞处理 | 牛血清白蛋白 | Thermo Fisher Scientific | 23209 |
| 血管内皮生长因子A | R&D Systems | 493-MV | |
| 干细胞因子 | R&D Systems | 455-MC | |
| 抑制剂处理 | dynasore | Sigma-Aldrich | 324410 |
| 渥曼青霉素 | Sigma-Aldrich | W1628 | |
| AKT1/2抑制剂 | Sigma-Aldrich | A6730 | |
| PD184352 | Sigma-Aldrich | PZ0181 | |
| SU-5402 | Sigma-Aldrich | SMl0443 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| 芦可替尼 | TOCRIS | 7064 | |
| ELISA | 小鼠SCF Quantikine ELISA试剂盒 | R&D systems | MCK00 |
| 脂质组学 | SPLASH脂质内标混合物 | Avanti Polar Lipids inc. | 330707 |
| 动物处理 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| CL316,247 | Sigma-Aldrich | C5976 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 去神经支配模型 | 手术方式（左侧肋间神经切断）、取样时间（术后3或5天）、样本量（n=4-6只/组）、对照（右侧完整I-BAT） 阅读提示：Methods 'Unilateral denervation of sympathetic nerves on BATs'；Fig. 2a,b |
| 热中性模型 | 温度（30°C）、暴露时间（3或5天）、对照温度（25°C）、样本量（n=4-6只/组） 阅读提示：Fig. 5a,e；Fig. 6a；Fig. 7a |
| 体外SCF处理 | SCF浓度（100 ng/mL）、处理时间（10分钟、6小时、12小时）、血清饥饿条件（1% FBS 12小时）、细胞模型（c-Kit过表达BA） 阅读提示：Methods 'c-Kit overexpression in immortalized pre-adipocytes and differentiation'；Fig. 3a,b |
| 抑制剂实验 | 抑制剂种类及浓度、预处理时间（1小时）、SCF处理时间（12小时） 阅读提示：Methods 'c-Kit overexpression in immortalized pre-adipocytes and differentiation'；Fig. 3c,d |
| 基因敲除小鼠 | c-Kit∆BA（UCP1-Cre × c-Kitflox/flox）和SCFiΔEC（VE-cadherin-Cre-ERT2 × SCFflox/flox）的诱导方案（他莫昔芬50 mg/kg连续3天）、年龄（8周龄）、性别（雄性） 阅读提示：Methods 'Mice and treatment'；Supplementary Figs. 8a, 10a |