出生后mLN非内皮SC单细胞图谱构建
解析出生后至老龄mLN非内皮SC的组成及年龄相关变化
取D0、D10、D24、D56、D300 SPF小鼠mLN，FACS分选CD45-CD24-细胞进行scRNA-seq，去除内皮和血管周细胞后重新嵌入非内皮SC并鉴定转录簇
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出生后肠系膜淋巴结基质细胞向网状基质细胞和CD34+基质细胞亚群的扩增
Postnatal expansion of mesenteric lymph node stromal cells towards reticular and CD34+ stromal cell subsets.
实验完整度
高含5个年龄点scRNA-seq、GF/SPF及Irf3-/-小鼠scRNA-seq、WGBS、ATAC-seq、RNA-seq、RNAscope及MSC过表达功能验证
主要模型
出生后至老龄SPF小鼠肠系膜淋巴结CD45-CD24-非内皮基质细胞 无菌(GF)与SPF小鼠肠系膜淋巴结及皮肤引流外周淋巴结非内皮基质细胞 Irf3-/-与野生型小鼠淋巴结非内皮基质细胞 小鼠C3H10T1/2间充质干细胞系
重点核对
mLN取材时间点为出生后D0、D10、D24、D56、D300；D0、D10、D24、D300各1个重复，D56为2个重复 GF/SPF比较中SPF小鼠为7–12周龄、GF小鼠为6–10周龄；SPF每种条件2个重复，GF pLN和mLN各1个新处理重复 WGBS和ATAC-seq的SPF vs GF、mLN vs pLN比较为每条件2–3个重复（WGBS）或3个重复（ATAC-seq） Irf3-/-与WT比较使用9–13周龄雄性小鼠，每条件1个重复 C3H10T1/2过表达实验中多西环素诱导12天，BRB-seq为每条件3–4个重复、来自两次独立实验
摘要
引流肠道的肠系膜淋巴结（LN）为塑造肠道适应性免疫应答提供结构框架。基于本团队前期工作所建立的转录特征，淋巴结基质细胞（SC）的组成和免疫调节功能随部位不同而变化。本文描述了出生后至老龄小鼠肠系膜淋巴结内SC区室的单细胞组成与发育。我们鉴定出CD34+ SC和成纤维网状基质细胞（FRC）祖细胞为推定祖细胞，二者共同支撑出生后肠系膜淋巴结典型的快速扩增。我们进一步建立了非内皮SC的部位特异性染色质可及性和DNA甲基化图谱，并鉴定出不依赖微生物群的核心表观基因组特征，显示肠系膜淋巴结与皮肤引流外周淋巴结SC之间存在特征性差异。SC的表观基因组图谱提示Irf3沿FRC分化轨迹动态表达。据此，间充质干细胞系在慢病毒过表达Irf3后获得Cxcl9+ FRC分子表型，而Irf3-/-小鼠淋巴结中Ccl19+和Cxcl9+ FRC比例下降进一步凸显了Irf3与SC生物学的相关性。总体而言，我们的数据构成了生命早期肠系膜淋巴结SC发育的全面转录与表观基因组图谱，并解析了非内皮SC的部位特异性、不依赖微生物群的特性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肠系膜淋巴结非内皮基质细胞在出生后如何组成与分化，其部位特异性表观基因组特征是否依赖微生物群，以及哪些转录因子调控关键SC亚群发育。
- 核心机制
- CD34+ SC与FRC两条分化轨迹分别由Cdk1+(CD34+)和Cdk1+(Cxcl13+)增殖性祖细胞启动；非内皮SC具有部位特异、不依赖微生物群的核心表观基因组特征，Irf3参与促进Cxcl9+ FRC分子表型并影响SC亚群比例平衡。
- 主要证据
- 对D0至D300小鼠mLN非内皮SC的scRNA-seq与Monocle拟时序分析、RNAscope定位、GF/SPF及mLN/pLN的WGBS、ATAC-seq与RNA-seq、C3H10T1/2中TF过表达的BRB-seq，以及Irf3-/-小鼠scRNA-seq。
- 研究意义
- 提供生命早期肠系膜淋巴结SC发育的转录与表观基因组资源，解析非内皮SC部位特异性且不依赖微生物群的特性，为鉴定组织特异性调控免疫应答的靶点提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RNAscope定位推定祖细胞
确定Cdk1+祖细胞在新生mLN中的空间位置
对D0新生mLN石蜡切片进行三色RNAscope，检测Cdk1、Cd34、Cd31、Cxcl13、Ccl19等RNA探针并用荧光显微镜成像
拟时序分析解析祖细胞-子代关系
推断Cdk1+(Cxcl13+)和Cdk1+(CD34+)细胞向FRC或CD34+ SC的分化轨迹
用Monocle2对非内皮SC进行无监督排序，并分别重建CD34+ SC和FRC轨迹；另对D0、D10、D24细胞单独进行拟时序分析
微生物群对SC组成影响的scRNA-seq比较
检验微生物定植是否改变mLN和pLN非内皮SC亚群组成
对GF和SPF小鼠mLN与pLN的CD45-CD24-细胞进行scRNA-seq整合分析，比较亚群比例并进行GO分析
部位与微生物依赖的表观基因组图谱
比较mLN与pLN、SPF与GF非内皮SC的DNA甲基化和染色质可及性
FACS分选CD45-CD24-CD31-Pdpn+非内皮SC，进行WGBS、ATAC-seq及RNA-seq，鉴定DMR、DAR并与基因表达关联
转录因子过表达筛选
验证表观基因组分析鉴定的TF能否驱动MSC向特定SC亚群表型分化
在C3H10T1/2细胞中慢病毒过表达候选TF，经嘌呤霉素筛选和多西环素诱导12天后进行形态观察和BRB-seq
Irf3缺陷小鼠体内验证
评估Irf3缺失对淋巴结SC亚群组成和表型的影响
FACS分选Irf3-/-与WT小鼠mLN和pLN的CD45-CD24-细胞进行scRNA-seq，比较亚群比例及Ccl19、Cxcl9表达
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流式细胞分析 | 抗CD11b抗体（克隆M1/70，AF700） | eBioscience | 56-0112-82 |
| 抗CD24抗体（克隆M1/69，APC） | BioLegend | 101814 | |
| 抗CD31抗体（克隆390，PE-Cy7） | BioLegend | 102418 | |
| 抗CD45抗体（克隆30-F11，APC） | BioLegend | 103112 | |
| 抗CD45抗体（克隆30-F11，HV510） | BD | 561487 | |
| 抗Pdpn抗体（克隆8.1.1，PE） | BioLegend | 127408 | |
| 抗Ly6G抗体（克隆1A8，PE-Cy7） | BD | 560601 | |
| 抗Ter119抗体（克隆Ly-76，APC） | Biolegend | 116212 | |
| 抗CD16/CD32抗体（克隆2.4G2） | BioXcell | BE0008 | |
| RNAscope FISH | RNAscope多重荧光检测试剂盒v2 | Advanced Cell Diagnostics | 320871 |
| 4-Plex辅助试剂盒 | Advanced Cell Diagnostics | 323120 | |
| Mm-Cdk1探针 | Advanced Cell Diagnostics | 476081 | |
| Mm-Cxcl13探针 | Advanced Cell Diagnostics | 406311-C2 | |
| Mm-Ccl19探针 | Advanced Cell Diagnostics | 432881-C2 | |
| Mm-CD34探针 | Advanced Cell Diagnostics | 319161-C3 | |
| Mm-CD31(Pecam1)探针 | Advanced Cell Diagnostics | 316721-C4 | |
| 蛋白酶Plus | Advanced Cell Diagnostics | 322380 | |
| Opal520、Opal570、Opal650荧光染料 | Perkin Elmer | NEL80001KT | |
| DAPI | Merck | D9542 | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P10144 | |
| 基质细胞分离 | 胶原酶P | Roche | 11213865001 |
| 中性蛋白酶 | Roche | 4942078001 | |
| DNase I | Roche | 4536282001 | |
| 抗APC磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| 抗CD45纳米磁珠 | Biolegend | 480028 | |
| 中性粒细胞流式分析 | 精确计数微球 | BioLegend | -- |
| 慢病毒包装 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher | 11668027 |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15140-122 | |
| 慢病毒转导 | 聚凝胺 | Sigma | TR-1003-G |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher | A1113803 | |
| 多西环素 | Sigma | D9891-1G | |
| RNA提取 | Direct-zol RNA试剂盒 | Zymo Research | R2052 |
| WGBS | AllPrep DNA/RNA微量试剂盒 | Qiagen | 80284 |
| TruSeq DNA样本制备试剂盒v2 | Illumina | 15026486 | |
| EZ DNA甲基化试剂盒 | Zymo Research | D5001 | |
| KAPA Hifi Uracil+聚合酶预混液 | Kapa Biosystems | KK2801 | |
| ATAC-seq | Nextera DNA文库制备试剂盒 | Illumina | FC-121-1031 |
| 洋地黄皂苷 | Promega | G9441 | |
| MinElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28006 | |
| NEBNext高保真2x PCR预混液 | New England BioLabs | M0541L | |
| SPRIselect磁珠 | Beckmann-Coulter | B23317 | |
| RNA-seq | RNeasy Plus微量试剂盒 | Qiagen | 74034 |
| SMART-Seq v4超低起始量RNA试剂盒 | Clontech Laboratories | R400752 | |
| Agencourt AMPure XP试剂盒 | Beckman Coulter | A63880 | |
| scRNA-seq | 单细胞3'试剂盒v2 | 10xGenomics | 120236 |
| BRB-seq | SuperScript II逆转录酶 | Lifetech | 18064014 |
| RNAse H | NEB | M0297S | |
| 大肠杆菌DNA连接酶 | NEB | M0205L | |
| 大肠杆菌DNA聚合酶 | NEB | M0209L | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| 高灵敏度NGS片段分析试剂盒 | Advanced Analytical | DNF-474 | |
| Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | Invitrogen | Q32851 | |
| High Output v2试剂盒（75循环） | Illumina | FC-404-2005 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠年龄与品系 | mLN取材年龄D0、D10、D24、D56、D300；GF小鼠6–10周龄、SPF小鼠7–12周龄；Irf3-/-与WT为9–13周龄雄性 阅读提示：Methods中Mice小节及Fig. 1、3、7图注 |
| scRNA-seq重复数与细胞数 | mLN发育数据D0、D10、D24、D300各1个重复、D56为2个重复；GF/SPF整合18,045个细胞、重新嵌入14,307个非内皮SC；Irf3-/-与WT各1个重复 阅读提示：Fig. 1、3、7图注及Methods中Library preparation scRNA-seq与scRNA-seq analysis |
| 表观基因组测序重复数 | WGBS每条件2–3个重复；ATAC-seq和RNA-seq每条件3个重复；分选表型为CD45-CD24-CD31-Pdpn+非内皮SC 阅读提示：Fig. 4图注及Methods中WGBS、ATAC-seq、RNA-seq相关小节 |
| 转录因子过表达条件 | 多西环素2 µl/ml诱导12天、每48 h更换；嘌呤霉素2 µl/ml筛选72 h；BRB-seq每条件3–4个重复、两次独立实验 阅读提示：Fig. 6图注及Methods中Lentiviral transduction与Library preparation BRB-seq |
| RNAscope条件与样本量 | D0新生儿mLN、3 µm切片、代表性切片n=2–3；阳性对照为POLR2A、PPIB、UBC、Hprt，阴性对照为DapB 阅读提示：Fig. 1图注及Methods中RNAscope FISH小节 |