构建NADH/NADPH操纵工具
模拟还原应激中NADH积累伴NADPH降低，并区分NADH与NADPH的作用。
构建Dox诱导表达EcSTH、PfSTH、LbNOX及其融合蛋白的HeLa细胞系，检测NADH/NAD+和NADPH/NADP+比值、乳酸/丙酮酸和β-羟丁酸/乙酰乙酸比值。
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鉴定嘌呤生物合成作为介导能量应激的NADH感应通路
Identification of purine biosynthesis as an NADH-sensing pathway to mediate energy stress.
实验完整度
高包含多种细胞系体外实验、全基因组CRISPR筛选、代谢组学、酶动力学、小鼠异种移植和乙醇肝损伤模型，并有功能与机制验证。
主要模型
HeLa细胞系 MDA-MB-231细胞系 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） 小鼠异种移植模型和急性乙醇灌胃模型
重点核对
HeLa细胞中Dox诱导EcSTH表达的时间与浓度（0.1 μg/mL或1 μg/mL） CRISPR筛选使用GeCKOV2和Brunello文库，MOI 0.3，Dox 0.1 μg/mL处理不同天数 嘌呤合成抑制剂6-MP（300 μM）、pelitrexol（10 μM）、lometrexol（10 μM）预处理2小时 小鼠乙醇灌胃剂量6 g/kg，9小时后取材；6-MP 100 mg/kg或pelitrexol 50 mg/kg预处理 代谢组学中13C6-葡萄糖和15N-酰胺-谷氨酰胺示踪的浓度与时间
摘要
增强的NADH/NAD+比值（称为还原应激）与许多疾病相关。然而，是否存在下游感应通路来介导致病结果仍不清楚。在这里，我们构建了来自大肠杆菌的可溶性吡啶核苷酸转氢酶（EcSTH），它可以提高NADH/NAD+比值，同时降低NADPH/NADP+比值。此外，我们将EcSTH与先前描述的LbNOX（一种来自短乳杆菌的产水型NADH氧化酶）融合，以恢复NADH/NAD+比值。利用这些工具，并通过在哺乳动物细胞中进行全基因组CRISPR/Cas9文库筛选和代谢谱分析，我们发现积累的NADH解除对PRPS2（核糖磷酸焦磷酸激酶2）介导的下游嘌呤生物合成的调控，从而引发大量能量消耗，进而诱导能量应激。阻断嘌呤生物合成可防止体外NADH积累相关的细胞死亡和体内组织损伤。这些结果强调了失调的嘌呤生物合成在NADH积累相关疾病中的病理生理作用，并证明了EcSTH在操纵NADH/NAD+和NADPH/NADP+方面的实用性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 还原应激中积累的NADH是否通过下游感应通路介导致病后果，以及该通路是什么。
- 核心机制
- 积累的NADH通过拮抗ADP对PRPS2的抑制性变构调节，间接激活PRPS2，促进嘌呤生物合成，导致大量ATP消耗和能量应激，进而引发细胞死亡。
- 主要证据
- 利用EcSTH和EcSTH-LbNOX工具在HeLa、MDA-MB-231和MEF细胞中操纵NADH/NAD+比值；全基因组CRISPR筛选鉴定TKT；代谢组学和15N-谷氨酰胺示踪显示嘌呤合成增加；PRPS2敲低和回补实验；NADH与PRPS2结合的SPR分析；小鼠乙醇灌胃模型显示阻断嘌呤合成减轻肝损伤。
- 研究意义
- 揭示了失调的嘌呤生物合成在NADH积累相关疾病中的病理生理作用，并证明EcSTH可用于操纵NADH/NAD+和NADPH/NADP+，提示控制嘌呤生物合成通路可能是治疗还原应激相关综合征的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证EcSTH诱导NADH积累导致细胞死亡
确定EcSTH引起的生长抑制和细胞死亡是否由NADH积累介导。
检测细胞增殖、克隆形成、异种移植瘤生长、凋亡指标（Annexin V、cleaved caspase-3、PARP1），并用α-酮丁酸、z-VAD-FMK、NSA、Ferr-1等干预。
全基因组CRISPR筛选鉴定NADH积累相关细胞死亡基因
寻找在低剂量Dox诱导EcSTH表达下加剧细胞死亡的基因。
使用GeCKOV2和Brunello sgRNA文库感染Cas9-EcSTH HeLa细胞，在0.1 μg/mL Dox或对照下培养，深度测序鉴定负向选择基因。
验证TKT敲除通过嘌呤合成加剧细胞死亡
确认TKT缺失如何影响NADH积累诱导的细胞死亡。
在EcSTH或EcSTH-LbNOX细胞中敲除TKT，检测细胞增殖，并进行代谢组学分析和嘌呤合成抑制剂干预。
证明嘌呤生物合成作为NADH感应通路
确定NADH积累是否促进从头嘌呤生物合成。
对EcSTH、LbNOX、EcSTH-LbNOX细胞进行代谢组学，使用13C6-葡萄糖和15N-酰胺-谷氨酰胺示踪，检测IMP、AMP、GMP标记及总含量。
确定NADH通过PRPS2激活嘌呤合成
探究NADH积累如何激活PRPS2介导的嘌呤合成。
纯化PRPS1/2并检测NADH/NAD+对酶活性的影响；SPR检测NADH与PRPS2结合；PRPS2敲低和回补实验；分子对接分析结合位点。
验证嘌呤合成导致能量应激和细胞死亡
确定嘌呤合成过度消耗ATP引发能量应激并介导细胞死亡。
检测细胞ATP水平、AMPK和ACC磷酸化；使用PRPS2敲低、嘌呤合成抑制剂、AMPK激活剂（AICAR、A769662）干预。
体内验证阻断嘌呤合成减轻NADH积累诱导的肝损伤
在体内检验嘌呤合成通路在还原应激相关组织损伤中的作用。
小鼠急性乙醇灌胃诱导NADH积累，预处理LbNOX慢病毒、6-MP或pelitrexol，检测肝脏NADH/NAD+、嘌呤核苷酸、ATP、ALT/AST和TUNEL。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141 C | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 药物处理 | 多西环素 | Sigma | D9891 |
| 6-巯基嘌呤 | MedChemExpress | HY-13677 | |
| 培利曲索 | MedChemExpress | HY-14530 | |
| 洛美曲索 | MedChemExpress | HY-14521B | |
| Z-VAD-FMK | MedChemExpress | HY-16658B | |
| 坏死磺酰胺 | MedChemExpress | HY-100573 | |
| 铁抑素-1 | MedChemExpress | HY-100579 | |
| A769662 | Selleck | S2697 | |
| AICAR | Selleck | S1802 | |
| Western blot | 抗Flag抗体 | Sigma | F1804 |
| PRPS1抗体 | Proteintech | 15549-1-AP | |
| PRPS2抗体 | Proteintech | 27024-1-AP | |
| TKT抗体 | Proteintech | 11039-1-AP | |
| 磷酸化ACC1 (Ser79)抗体 | CST | 3661 | |
| 磷酸化AMPK (Thr172)抗体 | CST | 2535 | |
| AMPK抗体 | CST | 5831 | |
| NADH/NAD+和NADPH/NADP+比值检测 | NADH发光检测试剂盒 | Promega | G9072 |
| NADPH发光检测试剂盒 | Promega | G9082 | |
| ATP检测 | CellTiter-Glo发光检测试剂盒 | Promega | G7570 |
| PRPS1/2活性检测 | Kinase-Glo试剂盒 | Promega | V6072 |
| 慢病毒浓缩 | Lenti-X浓缩试剂盒 | Clontech | 631231 |
| 蛋白质免疫印迹 | 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- |
| 增强化学发光试剂 | Millipore | WBKLS0500 | |
| 细胞凋亡检测 | Muse Annexin V & Dead Cell试剂盒 | Luminex | MCH100105 |
| 代谢物检测 | 酮体检测试剂盒 | Merck | MAK134 |
| 转酮醇酶活性检测 | 转酮醇酶活性检测试剂盒 | BioVision | K2004 |
| 蛋白质纯化 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Millipore | A2220 |
| 镍离子-琼脂糖亲和柱 | cytiva | 17-5248-01 | |
| CRISPR筛选 | 人GeCKO v2文库 | Addgene | 1000000049 |
| Brunello文库 | Addgene | 73178 | |
| LentiGuide-puro载体 | Addgene | 52963 | |
| 基因组DNA提取 | 血液与细胞培养Midi试剂盒 | Qiagen | 13343 |
| PCR | Herculase II融合DNA聚合酶 | Agilent | 600679 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与诱导表达 | 细胞系来源（HeLa、MDA-MB-231、MEF）、培养基（无丙酮酸DMEM用于NADH实验）、Dox浓度（0.1或1 μg/mL）和诱导时间（12-48小时） 阅读提示：Methods中Cell lines and reagents及Figure legends |
| CRISPR/Cas9全基因组筛选 | 文库（GeCKOV2和Brunello）、MOI（0.3）、Dox浓度（0.1 μg/mL）、培养天数（GeCKOV2：3天对照/7天Dox；Brunello：9天）、细胞数量（1.67×10^8感染，3×10^7每重复） 阅读提示：Methods中Genome-wide CRISPR screen及Fig. 4b |
| 嘌呤合成抑制剂处理 | 6-MP（300 μM）、pelitrexol（10 μM）、lometrexol（10 μM）预处理2小时，Dox 1 μg/mL处理48小时 阅读提示：Figure legends Fig. 5d和Fig. 4h |
| 小鼠急性乙醇灌胃模型 | 乙醇剂量（6 g/kg）、灌胃后9小时取材、6-MP（100 mg/kg）或pelitrexol（10 mg/kg）尾静脉预处理1小时、LbNOX慢病毒（3×10^8 PFU）预处理3天、小鼠品系和性别（雌性裸鼠仅用于异种移植，乙醇模型未明确说明品系） 阅读提示：Methods中Acute ethanol gavage model及Fig. 7a |
| 同位素示踪代谢组学 | 15N-酰胺-谷氨酰胺浓度（1 mM）、标记时间（12小时）、Dox预处理12小时、13C6-葡萄糖浓度（10 mM） 阅读提示：Methods中Metabolite profiling and isotope tracing及Fig. 5c |