alt-RPL36的鉴定与翻译起始确认
确认RPL36转录本变体2编码alt-RPL36并鉴定其起始密码子
在HEK 293T细胞中通过蛋白质组学鉴定alt-RPL36胰蛋白酶肽段；构建含5′UTR和alt-RPL36编码序列的myc标签质粒，转染HEK 293T细胞后进行Western blot；删除候选起始密码子G114TG或C165TG，并将G114TG突变为A114TG。
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Alt-RPL36通过与TMEM24相互作用下调PI3K-AKT-mTOR信号通路
Alt-RPL36 downregulates the PI3K-AKT-mTOR signaling pathway by interacting with TMEM24.
实验完整度
高结合质谱鉴定、CRISPR敲除/敲入细胞系、磷酸化位点突变、共免疫沉淀、活细胞成像及功能回补等多层验证
主要模型
HEK 293T细胞 alt-RPL36敲除HEK 293T细胞系 alt-RPL36-GFP11-FLAG敲入HEK 293T细胞系 alt-RPL36回补及4S-A回补HEK 293T细胞系
重点核对
alt-RPL36起始密码子为G114TG，位于RPL36转录本变体2的5′UTR alt-RPL36四个磷酸化位点为S19、S22、S140和S142 alt-RPL36与TMEM24的SMP和C2结构域相互作用，且需要alt-RPL36磷酸化 alt-RPL36敲除增加质膜PI(4,5)P2水平并上调PI3K-AKT-mTOR通路磷酸化 上述效应可被野生型而非4S-A突变体alt-RPL36回补
摘要
近期已注释了数千个人类小开放阅读框（smORFs）和替代开放阅读框（alt-ORFs）。许多alt-ORFs与经典蛋白以多顺反子构型共编码，但其功能鲜为人知。在此，我们报道了alt-RPL36的检测，这是一种与人类RPL36共编码的蛋白。Alt-RPL36部分定位于内质网，在那里它与TMEM24相互作用，TMEM24将磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PI(4,5)P2）前体磷脂酰肌醇从内质网运输到质膜。Alt-RPL36的敲除增加了质膜PI(4,5)P2水平，上调了PI3K-AKT-mTOR信号传导，并增加了细胞大小。Alt-RPL36包含四个磷酸丝氨酸残基，其点突变消除了与TMEM24的相互作用，并因此消除了alt-RPL36对PI3K信号传导和细胞大小的影响。这些结果提示alt-RPL36是PI3K-AKT-mTOR信号传导的上游调节因子。更广泛地说，RPL36转录本编码两个序列无关的多肽，它们通过不同的分子机制共同调节翻译，扩展了我们对多顺反子人类基因功能的认识。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 与人类RPL36共编码的alt-RPL36是否存在、其亚细胞定位、翻译起始、修饰及其生物学功能如何？
- 核心机制
- 磷酸化的alt-RPL36通过其磷酸丝氨酸残基与TMEM24的SMP和C2结构域相互作用，抑制TMEM24依赖的磷脂酰肌醇运输，从而下调PI3K-AKT-mTOR信号通路。
- 主要证据
- 在HEK 293T细胞中通过质谱鉴定alt-RPL36肽段，构建敲除、回补及4S-A回补细胞系，结合PH-PLC-GFP检测PI(4,5)P2、Western blot检测通路磷酸化、mRNA-seq和qRT-PCR、细胞体积测量及TMEM24敲低/敲除实验。
- 研究意义
- 提示alt-RPL36是磷脂运输和PI3K-AKT-mTOR信号传导的上游调节因子，并表明RPL36基因中重叠的ORF编码两个功能相关但机制不同的蛋白，扩展了对多顺反子人类基因功能的认识。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
alt-RPL36内源表达与内质网定位验证
验证alt-RPL36内源表达并确定其亚细胞定位
构建alt-RPL36-3xGFP11-FLAG敲入HEK 293T细胞系，进行FLAG免疫沉淀和Western blot；免疫染色观察alt-RPL36与内质网标记Grp94共定位；通过遗传密码扩展标记进行活细胞成像。
alt-RPL36磷酸化位点鉴定与验证
确定alt-RPL36的磷酸化位点及其化学计量
免疫纯化alt-RPL36-FLAG-HA，用磷酸酶处理并进行Western blot；LC-MS/MS鉴定磷酸化位点；通过Phos-tag SDS-PAGE和丝氨酸到丙氨酸点突变验证S19、S22、S140、S142。
alt-RPL36与TMEM24相互作用及结构域定位
验证alt-RPL36与TMEM24的相互作用及所需结构域和磷酸化条件
两步共免疫沉淀结合定量蛋白质组学鉴定相互作用蛋白；构建TMEM24截短突变体进行co-IP；比较野生型与4S-A突变体alt-RPL36与TMEM24的相互作用；共定位成像及TMEM24敲低实验。
alt-RPL36对PI(4,5)P2和PI3K-AKT-mTOR通路的功能验证
验证alt-RPL36对TMEM24依赖的PI(4,5)P2产生及下游信号通路的影响
构建alt-RPL36敲除、野生型回补和4S-A回补HEK 293T细胞系；用PH-PLC-GFP报告基因检测质膜PI(4,5)P2；Western blot检测AKT、TSC2、mTOR、S6K1、S6磷酸化；mRNA-seq和qRT-PCR检测转录输出；测量细胞体积。
TMEM24依赖性验证
验证alt-RPL36对PI3K-AKT-mTOR通路的调控是否依赖TMEM24
在alt-RPL36敲除背景上用shRNA敲低TMEM24或CRISPR敲除TMEM24，检测质膜PI(4,5)P2水平和通路磷酸化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 抗FLAG抗体 | Sigma | F3165 |
| 抗myc抗体 | Cell Signaling | 2276 | |
| 抗HA抗体 | Invitrogen | 71-5500 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Invitrogen | BA3R | |
| 抗磷酸化mTOR(S2448)抗体 | Cell Signaling Technology | 2971 | |
| 抗mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2972 | |
| 抗磷酸化AKT(S473)抗体 | Cell Signaling Technology | 9271 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 抗磷酸化TSC2(T1462)抗体 | Cell Signaling Technology | 3617 | |
| 抗TSC2抗体 | Cell Signaling Technology | 4308 | |
| 抗磷酸化S6K1(T389)抗体 | Cell Signaling Technology | 9234 | |
| 抗S6K1抗体 | Cell Signaling Technology | 9202 | |
| 抗磷酸化S6(S235/236)抗体 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| 抗S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2217 | |
| 抗RPL36抗体 | Bethyl Laboratories | A305065A-M | |
| 免疫沉淀 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma | A2220 |
| 抗HA标签磁珠 | Thermo Fisher | 88836 | |
| 药物处理 | Torin1 | Tocris | 4247 |
| 双吲哚马来酰亚胺II | Cayman | 11020 | |
| 毒胡萝卜素 | Sigma | T9033 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | 10-013-CV |
| 胎牛血清 | Sigma | F0392 | |
| 青霉素-链霉素 | VWR | 97063-708 | |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | -- | -- |
| Lipofectamine 3000 | -- | -- | |
| 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 23966-1 | |
| 活细胞成像 | 四嗪-硅罗丹明 | Spirochrome | -- |
| 内质网追踪蓝白DPX染料 | Thermo Fisher | -- | |
| 磷酸酶处理 | 小牛肠碱性磷酸酶 | NEB | M0290 |
| λ蛋白磷酸酶 | NEB | P0753 | |
| 重组蛋白纯化 | Co2+-TALON树脂 | Takara | 635606 |
| 体外磷酸化 | 蛋白激酶Cα | Invitrogen | P2232 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| alt-RPL36敲除细胞系构建 | gRNA序列、CRISPR-Cas9转染与筛选方法、敲除验证（基因组PCR测序、mRNA-seq/qRT-PCR） 阅读提示：Methods“Generation of alt-RPL36 knockout and knock-in cell lines”及Supplementary Fig. 7 |
| alt-RPL36磷酸化位点验证 | 四个磷酸化位点S19、S22、S140、S142的点突变组合、Phos-tag SDS-PAGE条件（50 μM Phos-tag丙烯酰胺、100 μM MnCl2） 阅读提示：Methods“Phos-tag SDS-PAGE and western blotting”及Fig. 3c |
| alt-RPL36与TMEM24相互作用验证 | TMEM24截短突变体设计、co-IP条件（anti-FLAG琼脂糖珠、4°C 1 h）、磷酸化缺陷型4S-A突变体 阅读提示：Methods“Co-immunoprecipitation”及Fig. 4d–g |
| PI(4,5)P2水平检测 | PH-PLC-GFP稳定表达细胞系、活细胞共聚焦成像参数、至少20个视野>400个细胞的定量分析 阅读提示：Methods“PH-PLC-GFP imaging”及Fig. 5a–c |
| TMEM24依赖性验证 | TMEM24 shRNA序列与敲低效率、CRISPR敲除TMEM24的gRNA、sh-Ctrl对照 阅读提示：Methods及Fig. 7、Supplementary Fig. 10 |