底物捕获筛选EglN2底物
在HIF-1α被 depleted 的TNBC细胞中富集并鉴定EglN2的非HIF底物。
在HIF-1α敲低的MDA-MB-231细胞中表达FLAG-HA-EglN2，缺氧+DMOG处理后进行TAP-TAG纯化；平行进行GST-EglN2 pull-down，随后质谱分析，取两种方法共同鉴定到的蛋白。
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脯氨酰羟化酶底物腺苷酸琥珀酸裂解酶是三阴性乳腺癌的致癌驱动因子
Prolyl hydroxylase substrate adenylosuccinate lyase is an oncogenic driver in triple negative breast cancer.
实验完整度
高结合底物质谱筛选、细胞CRISPR敲除、体外羟化、代谢组学、小鼠移植瘤及肺定植等多层级功能与机制验证
主要模型
MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞系 MDA-MB-436和MDA-MB-468三阴性乳腺癌细胞系 NSG小鼠乳腺脂肪垫原位移植瘤及尾静脉肺定植模型 TNBC患者肿瘤及癌旁正常乳腺组织
重点核对
底物捕获条件：缺氧（1% O2）+DMOG（1 mM）过夜处理，比较WT与催化失活H358A EglN2结合 ADSL敲除使用sgRNA #5和#6，并以dox诱导的CRISPR抗性ADSL进行回补 rescue ADSL P24A与R426H突变体的羟化及酶活性检测，底物SAMP 0.25 mM和SAICAR 0.15 mM 体内实验：MDA-MB-231约6×10^5细胞乳腺脂肪垫注射，或3×10^5细胞尾静脉注射NSG小鼠 代谢物回补：腺苷50 µM，延胡索酸20 µM，AICAR 1和25 µM
摘要
蛋白质羟化影响蛋白质稳定性、活性和相互作用组，因此参与包括癌症在内的多种疾病。然而，羟化反应的瞬时性阻碍了羟化酶底物的鉴定。通过开发一种酶-底物捕获策略，结合TAP-TAG或正交GST纯化后行质谱分析，我们在三阴性乳腺癌（TNBC）中鉴定出腺苷酸琥珀酸裂解酶（ADSL）为EglN2羟化酶的底物。ADSL在TNBC中的表达高于其他乳腺癌亚型或正常乳腺组织。ADSL敲除在体外和体内均损害TNBC细胞的增殖和侵袭能力。整合转录组学和代谢组学分析揭示，ADSL通过一种需要ADSL脯氨酸24羟化的机制调控cMYC蛋白水平，从而激活致癌性cMYC通路。具有羟化能力的ADSL通过影响腺苷水平抑制长链非编码RNA MIR22HG的表达，从而上调cMYC蛋白水平。我们的发现突出了ADSL羟化在调控cMYC和TNBC肿瘤发生中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- EglN2在TNBC中的致癌作用是否由其羟化HIF-1α以外的底物介导，该底物及其作用机制为何。
- 核心机制
- EglN2羟化ADSL脯氨酸24位，维持ADSL酶活性，进而调控腺苷和腺嘌呤水平；腺苷/腺嘌呤抑制长链非编码RNA MIR22HG表达，从而上调cMYC蛋白水平并促进TNBC细胞生长。
- 主要证据
- 通过底物捕获结合TAP-TAG与GST pull-down质谱鉴定ADSL为EglN2底物；ADSL敲除在TNBC细胞系和小鼠移植瘤/肺定植模型中损害增殖、侵袭和肿瘤生长；P24A突变体丧失回补ADSL缺失表型的能力；代谢组学与RNA-seq及回补实验连接腺苷、MIR22HG与cMYC。
- 研究意义
- 研究提示EglN2-ADSL-cMYC轴可能作为TNBC的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ADSL与EglN2的直接相互作用及底物关系
确认ADSL与EglN2结合，并判断其是否为催化依赖性底物。
GST-EglN2 pull-down检测ADSL；免疫沉淀WT与H358A EglN2比较ADSL结合；内源性EglN2/ADSL互作免疫沉淀；体外翻译ADSL与重组EglN2的GST pull-down；比较EglN1/2/3与ADSL结合。
评估ADSL对TNBC细胞增殖和侵袭的功能作用
确定ADSL是否参与TNBC细胞的增殖、锚定非依赖生长和侵袭。
用CRISPR-Cas9 sgRNA #5/#6敲除ADSL，检测2-D增殖、软琼脂集落形成和Matrigel侵袭；用dox诱导的CRISPR抗性ADSL进行回补；在MDA-MB-436和MDA-MB-468中验证。
体内验证ADSL对肿瘤生长和肺定植的作用
检测ADSL缺失对TNBC原位肿瘤生长和肺转移定植的影响。
将对照或ADSL sgRNA的荧光素酶标记MDA-MB-231细胞注射至NSG小鼠乳腺脂肪垫或尾静脉，通过生物发光成像和瘤重评估。
鉴定ADSL羟化位点及其对酶活性的影响
确定EglN2羟化ADSL的脯氨酸位点，并检验该位点对ADSL活性的贡献。
体外用重组EglN2羟化GST-ADSL并行质谱；细胞中转染HA-ADSL并用MG132或MG132+DMOG处理；pan-hydroxyproline IP检测WT与P24A；用SAMP和SAICAR测定WT、P24A、R426H酶活性。
整合代谢组与转录组解析ADSL下游通路
寻找ADSL影响TNBC表型所依赖的代谢和转录变化。
对ADSL敲除细胞进行约300种代谢物谱分析和RNA-seq/GSEA；检测cMYC蛋白及靶基因；用腺苷、延胡索酸、AICAR及各种核苷/碱基进行回补。
验证腺苷/腺嘌呤-MIR22HG-cMYC调控链
确定ADSL通过MIR22HG调控cMYC蛋白水平。
验证ADSL敲除后MIR22HG上调及cMYC下降；过表达或siRNA敲低MIR22HG检测cMYC；用WT或P24A ADSL回补检测MIR22HG；用腺苷或腺嘌呤处理检测MIR22HG恢复。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| RPMI培养基 | -- | -- | |
| MEGM培养基 | Lonza | -- | |
| 潮霉素 | -- | -- | |
| G418 | -- | -- | |
| 杀稻瘟菌素 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891 |
| 富马酸二乙酯 | Sigma-Aldrich | D95654 | |
| 腺苷 | Sigma-Aldrich | A4036 | |
| 胸苷 | Sigma-Aldrich | T1895 | |
| 胞苷 | Sigma-Aldrich | C4654 | |
| 尿苷 | Sigma-Aldrich | U3750 | |
| 肌苷 | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| 次黄嘌呤 | Sigma-Aldrich | H9377 | |
| 鸟苷 | Sigma-Aldrich | G6264 | |
| 二甲基草酰甘氨酸 | Frontier Scientific | D1070-1g | |
| MG132蛋白酶体抑制剂 | Peptide International | IZL-3175-v | |
| AICAR | Santa Cruz Biotechnology | sc-200659 | |
| 腺嘌呤 | Santa Cruz Biotechnology | sc-291834 | |
| 质粒构建 | Quick Change XL定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | 200516 |
| siRNA转染 | 靶向MIR22HG的siRNA | Dharmacon | RU-015037-00-0002 |
| 病毒包装与感染 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | -- |
| Western blot | 抗ADSL抗体 | Sigma-Aldrich | HPA000525 |
| 抗vinculin抗体 | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| 抗α-tubulin抗体 | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| 抗羟脯氨酸抗体 | Abcam | ab37067 | |
| 抗APRT抗体 | Abcam | ab91428 | |
| 抗HIF-1α抗体 | Cell Signaling Technology | 14179 | |
| 抗cMYC抗体 | Cell Signaling Technology | 5605 | |
| 抗RRM1抗体 | Cell Signaling Technology | 8637 | |
| 抗4EBP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9644 | |
| 抗AMPK抗体 | Cell Signaling Technology | 5832 | |
| 抗磷酸化AMPK抗体 | Cell Signaling Technology | 2535 | |
| 抗磷酸化4EBP1抗体 | Cell Signaling Technology | 2855 | |
| 抗FLAG抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗GST抗体 | Cell Signaling Technology | 2625 | |
| 抗HA标签抗体 | BioLegend | 901501 | |
| 抗vimentin抗体 | BD Biosciences | 550513 | |
| 抗EglN2抗体 | Novus Biologicals | NB100-310 | |
| 抗RRM2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376973 | |
| 抗CAD抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376072 | |
| 抗TYMS抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-390945 | |
| 抗DHODH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166348 | |
| 抗GMPS抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376163 | |
| 抗β-actin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| 抗CTPS1抗体 | Thermo Fisher Scientific | A304-543A | |
| 过氧化物酶偶联山羊抗小鼠抗体 | Thermo Fisher Scientific | 31430 | |
| 过氧化物酶偶联山羊抗兔抗体 | Thermo Fisher Scientific | 31460 | |
| 免疫沉淀 | 抗EglN2抗体 | Abcam | ab113077 |
| 抗ADSL抗体 | Abcam | ab151958 | |
| 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 3F10 HA偶联磁珠 | Roche Applied Bioscience | -- | |
| 蛋白G琼脂糖珠 | Roche Applied Bioscience | -- | |
| TAP-TAG纯化 | FLAG肽 | Sigma-Aldrich | F3290 |
| Pierce离心柱 | Thermo Fisher Scientific | 89898 | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | 完全蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Roche Applied Biosciences | -- |
| 细胞侵袭 | BD BioCoat Matrigel侵袭小室 | BD | 354480 |
| Diff-Quick染色试剂盒 | SIEMENS | B4132-1A | |
| EVOS XL Core显微镜 | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | |
| 动物实验 | 基质胶 | Corning | 354234 |
| 荧光素 | -- | -- | |
| 生物发光成像 | IVIS成像相机 | Xenogen | -- |
| 代谢组学 | Xbridge酰胺柱 | Waters | -- |
| Ultimate 3000超高效液相色谱 | Dionex | -- | |
| Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 羟化位点质谱 | Q-Exactive质谱仪 | Thermo | -- |
| RNA提取 | RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA-seq建库 | TruSeq RNA文库制备试剂盒v2 | Illumina | -- |
| RT-PCR | iScript cDNA合成试剂盒 | Biorad | -- |
| iTaq通用SYBR Green预混液 | BioRad | -- | |
| 软琼脂集落形成 | 碘硝基四唑氯化物溶液 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 底物捕获与质谱筛选 | 缺氧条件为1% O2，DMOG浓度1 mM，处理过夜；HIF-1α敲低细胞；WT与H358A EglN2对照 阅读提示：Methods中TAP-TAG purification及In vitro hydroxylation前文；Fig. 1图注 |
| ADSL敲除与回补细胞实验 | ADSL sgRNA #5和#6序列、对照sgRNA序列；dox诱导ADSL回补的表达水平及抗生素筛选浓度 阅读提示：Methods中Lentiviral sgRNA vectors, sgRNAs, shRNAs, and siRNAs及Cell culture and reagents；Fig. 2图注 |
| ADSL酶活测定 | 底物SAMP 0.25 mM、SAICAR 0.15 mM，20 ng蛋白，37°C 20 min；WT、P24A、R426H比较 阅读提示：Methods中ADSL activity assay；Fig. 4g |
| 核苷/代谢物回补实验 | 腺苷50 µM，延胡索酸20 µM，AICAR 1和25 µM；每日更换；其他核苷和碱基浓度文中未明确说明 阅读提示：Methods中Cell proliferation assay；Fig. 5h、i与Supplementary Fig. 5i |
| 小鼠原位移植瘤和肺定植 | 6周龄雌性NSG小鼠；MDA-MB-231约6×10^5细胞乳腺脂肪垫注射，MDA-MB-468约5×10^5；尾静脉约3×10^5细胞；luciferin 150 mg/kg；观察终点6/11周或8/9周 阅读提示：Methods中Orthotopic tumor growth和Breast cancer lung colonization；Fig. 3图注 |