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        利用单细胞RNA测序分析人乳腺上皮细胞并鉴定细胞多样性

        Profiling human breast epithelial cells using single cell RNA sequencing identifies cell diversity.

        作者信息Quy H Nguyen, Nicholas Pervolarakis, Kerrigan Blake, Dennis Ma, Ryan Tevia Davis, Nathan James, Anh T Phung, Elizabeth Willey, Raj Kumar, Eric Jabart, Ian Driver, Jason Rock, Andrei Goga, Seema A Khan, Devon A Lawson, Zena Werb, Kai Kessenbrock
        PMID29795293
        期刊Nat Commun
        发布时间2018-05-23
        DOI10.1038/s41467-018-04334-1
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        含scRNAseq（微流控与液滴平台）、免疫荧光蛋白验证、单细胞Western blot及多方法轨迹分析

        主要模型

        7名个体缩乳术样本的原代人乳腺上皮细胞 Fluidigm C1微流控scRNAseq（3名个体868个细胞） 10× Genomics液滴scRNAseq（4名个体24,646个细胞）

        重点核对

        FACS分选：基底（CD49f-hi/EPCAM+）与腔面（CD49f+/EPCAM-hi），并排除CD31/CD45+及SytoxBlue死细胞 微流控scRNAseq质控：去除检测基因<900的细胞；液滴scRNAseq去除基因<500或>6000及线粒体基因>10%的细胞 免疫荧光抗体标记：ZEB1/KRT14、TCF4/SMA、SLPI/NY-BR-1、ER/PR/AR、Ki67等 单细胞Western blot：约2000细胞/芯片，KRT8与β-tubulin荧光检测 Monocle伪时间分析：液滴数据随机抽取4000细胞（每人1000）

        摘要

        乳腺癌起源于获得遗传改变、随后导致组织稳态丧失的乳腺上皮细胞。已有研究提出若干不同的上皮亚群，但对人乳腺中异质性谱系和分化层级的完整理解仍不清楚。本文中，我们利用单细胞mRNA测序（scRNAseq）对来自7名个体缩乳术样本的25,790个原代人乳腺上皮细胞进行了转录组分析。无偏聚类分析揭示存在三种不同的上皮细胞群体，一种基底型和两种腔面细胞类型，我们将其鉴定为分泌型L1和激素反应型L2细胞。分化轨迹的伪时间重建产生了一个连续的谱系层级，将基底谱系与两个分化的腔面分支紧密连接。我们的综合细胞图谱为理解人乳腺上皮的细胞蓝图提供了见解，并将为理解该系统在乳腺癌中如何失常奠定基础。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        人乳腺上皮存在哪些细胞类型与状态，其异质性谱系及分化层级如何，并与乳腺癌亚型有何关系。
        核心机制
        基底乳腺干细胞/祖细胞经一个连续的谱系层级分化为肌上皮细胞及两种腔面细胞L1（分泌型）和L2（激素反应型）；L1.2可能为腔面限制性双潜能祖细胞。
        主要证据
        对7名个体原代乳腺上皮细胞进行微流控和液滴scRNAseq，鉴定出Basal、Myo、L1.1、L1.2、L2等细胞状态；免疫荧光和单细胞Western blot在蛋白及空间层面验证；Monocle伪时间重建显示连续分化轨迹。
        研究意义
        提供人乳腺上皮细胞图谱，为理解乳腺癌早期发生及各亚型细胞起源奠定基础，并可能有助于改进癌症早期检测和预防策略。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        原代乳腺上皮细胞分离与FACS分选

        获得高纯度基底与腔面上皮细胞用于单细胞测序

        缩乳术样本经胶原酶消化获得类器官，胰酶消化为单细胞悬液，用CD31、CD45、EpCAM、CD49f抗体及SytoxBlue进行FACS分选。

        2

        微流控scRNAseq分析

        无偏鉴定乳腺上皮主要细胞类型

        分选的基底和腔面细胞分别加载至Fluidigm C1芯片，捕获后显微成像排除双细胞和碎片，建库并测序。

        3

        液滴scRNAseq分析

        扩大通量以发现更多细胞状态和亚群

        将基底和腔面细胞合并，使用10× Genomics Chromium平台进行scRNAseq，Seurat聚类分析。

        4

        免疫荧光空间验证

        在蛋白和空间层面验证新发现的细胞类型与状态

        对组织切片进行ZEB1、TCF4、KRT14、SMA、SLPI、NY-BR-1、ER、PR、AR、Ki67等免疫荧光染色并定量。

        5

        单细胞Western blot蛋白定量

        定量验证KRT8在单细胞水平的表达分布

        FACS分选的乳腺上皮细胞沉降于scWest芯片，裂解、电泳分离、UV固定，用抗KRT8和抗β-tubulin抗体检测。

        6

        Monocle伪时间轨迹重建

        重建细胞类型间的分化层级关系

        利用Monocle 2对液滴scRNAseq数据随机抽样细胞进行伪时间排序，生成分化轨迹。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        流式细胞术免疫荧光
        单细胞转录组分析
        单细胞RNA测序Seurat聚类分析t分布随机邻域嵌入基因评分
        验证分子表达变化
        单细胞Western blot定量免疫荧光
        机制链路与轨迹分析
        Monocle伪时间分析Ingenuity通路分析Enrichr基因集富集分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        组织消化I型胶原酶Life Technologies17100-017
        胰酶Corning25-052-CI
        DNA酶Sigma AldrichD4263-5VL
        FACS分选CD31抗体eBiosciences48-0319-42
        CD45抗体eBiosciences48-9459-42
        EpCAM抗体eBiosciences50-9326-42
        CD49f抗体eBiosciences12-0495-82
        SytoxBlue活力染料Life TechnologiesS34857
        微流控scRNAseqFluidigm C1悬浮试剂Fluidigm100-5315
        C1芯片Fluidigm100-5760
        显微成像Keyence BZ-X710显微镜Keyence--
        cDNA文库定量Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒Life TechnologiesQ32851
        高灵敏度DNA芯片Agilent5067-4626
        文库定量KAPA qPCR试剂Kapa BiosystemsKK4824
        测序Illumina HiSeq2500测序仪Illumina--
        Illumina HiSeq4000测序仪Illumina--
        免疫荧光雌激素受体（ER）大鼠单克隆抗体--916201
        KRT14兔多克隆抗体BiolegendPRB-155P
        雄激素受体（AR）兔单克隆抗体Cell Signaling5153
        孕激素受体（PR）兔单克隆抗体Cell Signaling8757
        KRT8（TROMA-1）小鼠单克隆抗体DSHB--
        SLPI山羊多克隆抗体R&D SystemsAF1274-SP
        α-平滑肌肌动蛋白小鼠单克隆抗体GeneTexGTX60466
        Ki67单克隆抗体GeneTexGTX16667
        TP63兔多克隆抗体GeneTexGTX102425
        TCF4兔多克隆抗体GeneTexGTX54531
        NY-BR-1小鼠单克隆抗体Thermo Fisher ScientificMS-1932-P0
        含DAPI的抗荧光淬灭封片剂Vector LaboratoriesH-1200
        单细胞Western blot单细胞Western blot仪MiloProteinSimple--
        scWest芯片ProteinSimple--
        小鼠抗角蛋白8抗体Abcamab9023
        兔抗β-微管蛋白抗体Abcamab6046
        驴抗兔IgG Alexa 647ThermoFisherA-31573
        驴抗小鼠IgG Alexa 488ThermoFisherA-21202
        单细胞Western blot成像Molecular Devices Genepix 4400A扫描仪Molecular Devices--

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        原代细胞分离与FACS分选
        样本来源与类型（缩乳术组织）；消化条件：Collagenase Type I 2 mg/mL过夜、0.05%胰酶含DNase；分选标记：CD31、CD45、EpCAM、CD49f、SytoxBlue；活力要求≥80%
        阅读提示：Methods 中“Single-cell RNA sequencing”小节
        微流控scRNAseq
        3名个体、13张C1芯片、868个细胞；平均读深约1.6M reads/细胞；质控去除检测基因<900的细胞
        阅读提示：Results 中“scRNAseq reveals three cell types”及Methods 中“Single-cell RNA sequencing”“Processing of scRNAseq data”
        液滴scRNAseq
        4名个体（Ind4-7）共24,646个细胞；平均约60,000 reads/细胞；质控基因500–6000、线粒体<10%
        阅读提示：Results 中“Droplet-mediated scRNAseq”及Methods 中“Processing of scRNAseq data”
        Seurat聚类与基因评分
        Seurat版本（1.2.1与2.0.0）、主成分数（前两个/前十）、RegressOut校正参数；基因评分使用100个对照基因及Wilcox检验95%置信区间
        阅读提示：Methods 中“Cluster identification using Seurat”“Gene scoring”
        免疫荧光
        10 μm切片、抗原修复10 mM柠檬酸缓冲液、一抗稀释比例与货号、计数方式（40×物镜、至少3个视野、至少2个样本）
        阅读提示：Methods 中“Immunofluorescence analysis”及抗体列表
        单细胞Western blot
        约2000细胞/芯片、电泳240 V 1 min、UV固定4 min、抗体浓度（KRT8 200 µg/mL、β-tubulin 100 µg/mL）
        阅读提示：Methods 中“Single-cell western blot”
        Monocle伪时间分析
        Monocle版本2.2.0、随机抽取4000细胞（每人1000）、相关阈值0.8
        阅读提示：Methods 中“Reconstructing differentiation trajectories using Monocle”

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