建立hTDP-43小鼠模型
研究TREM2在TDP-43蛋白病中的作用
通过新生小鼠ICV注射AAV9.CAG.hTDP-43.GFP，以及成年小鼠初级运动皮层立体定位注射，在神经元中表达hTDP-43。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
TREM2与TDP-43相互作用并介导小胶质细胞对TDP-43相关神经变性的神经保护作用
TREM2 interacts with TDP-43 and mediates microglial neuroprotection against TDP-43-related neurodegeneration
实验完整度
高包含多种独立证据层级：体外共免疫沉淀、体内免疫共沉淀、SILAC质谱、SPR、MD模拟及多种小鼠模型和人类组织验证，并进行功能验证。
主要模型
新生小鼠ICV注射AAV9.CAG.hTDP-43.GFP模型 成年小鼠初级运动皮层立体定位注射模型 rNLS8转基因小鼠模型 人iPSC来源神经元
重点核对
TREM2敲除对hTDP-43诱导的行为和病理的影响（新生ICV模型） hTDP-43诱导的CD11c+小胶质细胞亚群是否依赖TREM2 TREM2介导的小胶质细胞对hTDP-43的吞噬作用 TDP-43与TREM2的相互作用（体外、体内及人组织） TREM2与hTDP-43的SPR结合动力学
摘要
髓系细胞触发受体2（TREM2）与神经退行性疾病风险相关。然而，TREM2在神经变性中的功能仍不完全清楚。本研究利用病毒介导和转基因小鼠模型，探讨了小胶质细胞TREM2在TAR-DNA结合蛋白43 kDa（TDP-43）相关神经变性中的作用。我们发现，TREM2缺陷损害了小胶质细胞对病理性TDP-43的吞噬清除，并加剧了神经元损伤和运动障碍。质谱流式分析显示，hTDP-43诱导了一个TREM2依赖的、具有高CD11c表达和吞噬能力的小胶质细胞亚群。利用质谱和表面等离子体共振分析，我们进一步证明了TDP-43与TREM2在体外和体内以及ALS患者组织中的相互作用。我们通过计算鉴定了hTDP-43中与TREM2相互作用的区域。我们的数据强调，TDP-43可能是小胶质细胞TREM2的一个配体，这种相互作用介导了小胶质细胞在TDP-43相关神经变性中的神经保护作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TREM2在TDP-43相关神经变性中的功能及其机制是什么？
- 核心机制
- TDP-43是TREM2的配体，TREM2与病理性TDP-43的相互作用介导小胶质细胞对TDP-43的吞噬清除和神经保护。
- 主要证据
- TREM2缺失导致小胶质细胞吞噬功能受损、CD11c+亚群消失、TDP-43累积增加和运动功能恶化；免疫共沉淀、SILAC质谱和SPR证实TDP-43与TREM2直接结合。
- 研究意义
- 本研究指出小胶质细胞TREM2是改善TDP-43相关神经变性的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估TREM2缺失对神经变性和运动功能的影响
确定TREM2在hTDP-43诱导的神经变性中的作用
比较WT和TREM2 KO小鼠的生存率、后肢抓握、转棒表现、Nissl染色和NeuN染色，并检测可溶性和不溶性hTDP-43水平。
分析小胶质细胞表型变化
研究TREM2缺陷对hTDP-43诱导的小胶质细胞反应的影响
使用CyTOF分析小胶质细胞亚群，并通过免疫染色检查CD11c、P2Y12和TMEM119等标记物。
验证TREM2介导的吞噬清除作用
确定TREM2是否介导小胶质细胞对hTDP-43的吞噬和清除
通过CD68染色、GFP-hTDP-43与Iba1共定位、以及可溶性和sarkosyl不溶性蛋白的Western blot检测。
验证TDP-43与TREM2的相互作用
证明TDP-43与TREM2在体外和体内相互作用
通过共免疫沉淀、LC-MS/MS和SILAC分析鉴定相互作用，并在rNLS8小鼠和ALS患者组织中验证。
计算模拟和SPR验证结合位点
确定TDP-43与TREM2的结合位点和亲和力
使用分子动力学模拟预测hTDP-43的低复杂度结构域片段与hTREM2胞外域的结合，并通过SPR测量结合动力学。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| Geltrex基质胶 | Gibco | -- | |
| 病毒注射 | AAV9.CAG.hTDP-43.GFP病毒 | -- | -- |
| 免疫染色 | 抗NeuN抗体 | Abcam | ab104225 |
| 抗CD68抗体 | Abcam | ab125212 | |
| 抗CD11c抗体 | Thermo | 14011482 | |
| 抗P2Y12抗体 | Anaspec | AS-55043A | |
| 抗Iba1抗体 | Abcam | ab178847 | |
| 抗磷酸化TDP-43抗体 | Proteintech | 22309-1-AP | |
| 抗GFAP抗体 | CST | 3670 | |
| 抗CNPase抗体 | Proteintech | 13427-1-AP | |
| 抗TMEM119抗体 | Abcam | ab209064 | |
| 抗TREM2抗体 | R&D | AF1729 | |
| Alexa Fluor二抗 | Thermo | a32740, a11016 | |
| Alexa Fluor驴抗羊594 | Thermo | a11016 | |
| Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | -- | |
| 免疫组化 | hTDP-43抗体 | Proteintech | 60019-2-Ig |
| 磷酸化hTDP-43抗体 | Proteintech | 22309-1-AP | |
| M.O.M.免疫检测试剂盒 | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| 生物素化二抗 | Vector Laboratories | BA-9200 | |
| Vectastain-ABC试剂盒 | Vector Laboratories | -- | |
| ImmPACT DAB底物过氧化物酶(HRP)试剂盒 | Vector Laboratories | -- | |
| DEPEX封片剂 | Electron Microscopy Science | -- | |
| CyTOF | 成人脑组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-107-677 |
| Maxpar细胞染色缓冲液 | Fluidigm | -- | |
| Helios质谱流式系统 | Fluidigm | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | Cell signaling | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 十二烷基肌氨酸钠 | -- | -- | |
| 免疫印迹 | 抗hTDP-43抗体 | Proteintech | 60019-2-Ig |
| 抗总TDP-43抗体 | Proteintech | 10782-2-AP | |
| 抗磷酸化TDP-43(Ser409/410)抗体 | COSMOBIO | CAC-TIP-PTD-M01 | |
| 抗GFP抗体 | Cell signaling | 2956s | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz | sc-32233 | |
| 免疫共沉淀 | Myc-Trap琼脂糖珠 | Chromotek | yta-10 |
| GFP-Trap琼脂糖珠 | Chromotek | gta-10 | |
| 抗Myc抗体 | Sigma | SAB4700447 | |
| TREM2生物素化抗体 | R&D | BAF1729 | |
| NeutrAvidin琼脂糖珠 | Thermo Fisher | 29200 | |
| 抗小鼠TREM2抗体[5F4] | abcam | ab252876 | |
| 抗人TREM2抗体 | Cell Signaling | 91068 | |
| Dynabeads蛋白A | Thermo fisher | 22810 | |
| 抗人TREM2抗体(山羊) | R&D | AF1828 | |
| 两性离子去污剂3-16 | -- | -- | |
| LC-MS/MS | Q Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| 纳升液相系统 | Dionex | -- | |
| SILAC | 含重同位素氨基酸的DMEM | -- | -- |
| SPR | Biacore T200生物大分子相互作用分析仪 | GE Healthcare Life Sciences | -- |
| 人TREM2蛋白 | Sino Biological | 11084-H08H | |
| 人TDP-43蛋白 | R&D | AP-190-100 | |
| CM5传感芯片 | GE Healthcare Life Sciences | -- | |
| 氨基偶联试剂盒 | GE Healthcare Life Sciences | -- | |
| 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC) | -- | -- | |
| N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) | -- | -- | |
| 显微镜 | 共聚焦显微镜LSM510 | Zeiss | -- |
| 荧光显微镜BZ-X800 | Keyence | -- | |
| 行为学 | 旷场活动箱 | Med Associates | -- |
| 转棒仪 | Med Associates Inc | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 新生小鼠ICV注射病毒滴度和体积（9.0E+12 vg/mL，2μL），成年小鼠立体定位注射坐标和参数，TREM2 KO小鼠品系 阅读提示：Methods: Intracerebroventricular injections, Stereotaxic intracerebral injection, Mice |
| 病毒表达 | AAV9.CAG.hTDP-43.GFP和AAV9.CAG.Empty对照，表达水平验证 阅读提示：Methods: Intracerebroventricular injections, 图1a，扩展数据图1 |
| 行为学测试 | 后肢抓握评分标准和测试时间，转棒加速方案，旷场测试时间 阅读提示：Methods: Hindlimb clasping, Open field testing, Rotarod |
| 小胶质细胞表型分析 | CyTOF抗体面板和样本处理，CD11c+亚群门控策略 阅读提示：Methods: Mass cytometry/CyTOF of isolated brain cells, 图2，扩展数据图4 |
| 蛋白相互作用 | 免疫共沉淀抗体和条件，SILAC标记，SPR蛋白浓度和芯片 阅读提示：Methods: Immunoprecipitation assay, SILAC, Surface Plasmon Resonance |