MCCv平台开发与验证
建立基于单等位基因染色质结构的高分辨率变异到功能平台。
开发Micro Capture-C变异到功能平台（MCCv），使用寡核苷酸探针在杂合细胞中捕获变异位点，分析短程（<800 bp）纳米尺度染色质结构和长程（1 kb-1 Mb）相互作用，并在Jurkat细胞中验证42个获得性功能增强子变异。
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调控变异的单等位基因纳米尺度作图
Single-allele nanoscale mapping of regulatory variants
实验完整度
高包含体外细胞系、原代CD4+ T细胞、基因组编辑、小鼠EAE模型、患者样本及多组学验证，具备功能与机制验证。
主要模型
Jurkat细胞系（clone E6-1） 原代人CD4+ T细胞 rs4409785杂合供体外周血样本 C57/BL6小鼠EAE模型（移植Sesn3敲除HSPC）
重点核对
MCCv在Jurkat细胞中分析42个杂合获得性功能增强子变异，6个独立MCC文库重复 MCCv在原代CD4+ T细胞中捕获405个顺式调控元件，来自3名供体 碱基编辑实验：BE4max mRNA 2 µg，sgRNA 100 pmol，电转程序EO-115，6个技术重复，编辑效率~50% 小鼠EAE模型：C57/BL6小鼠接受5.5 Gy×2照射，静脉注射500,000个编辑的CD117+ HSPC，n=6只/组 Co-IP和Western blot：SESN3-FLAG与GATOR2在饥饿条件下互作，色氨酸（500 µM）处理1小时
摘要
数百万个遗传变异与人类疾病相关，但鉴定其潜在机制具有挑战性，因为大多数变异是非因果性的，且位于非编码基因组中。我们开发了一种基于单等位基因染色质结构分析的Micro Capture-C变异到功能平台（MCCv）。该平台可以识别纳米尺度染色质结构的变化，并将顺式调控元件中的变异与靶基因联系起来。此外，MCCv可以对本位点内的其他杂合变异进行定相，从而将调控变异与等位基因不平衡的基因表达联系起来，并在基因组编辑后直接读出变异对染色质相互作用的影响。利用这种方法，我们研究了CD4+ T细胞中与免疫介导炎症性疾病相关的405个顺式调控元件。我们发现了一种先前未描述的获得性功能机制，该机制通过创建一个新的CTCF基序来阻断超级增强子与SESN3启动子的接触，从而增加自身免疫风险。我们证明SESN3通过感知色氨酸来调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，并使用小鼠模型证明了其在自身免疫中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在高分辨率下鉴定非编码区疾病相关变异的功能及其靶基因，并揭示其致病机制？
- 核心机制
- MCCv鉴定出rs4409785风险等位基因创建一个新的CTCF结合基序，该基序与下游收敛CTCF位点竞争，形成亚结构域阻断T细胞特异性超级增强子与SESN3启动子的接触，降低SESN3表达；SESN3通过感知色氨酸与GATOR2互作抑制mTOR信号，其表达降低导致低色氨酸条件下mTOR信号增强，促进自身免疫。
- 主要证据
- MCCv在CD4+ T细胞中分析405个顺式调控元件，发现54.6%的杂合变异有显著等位基因特异性接触变化；rs4409785风险等位基因产生新的CTCF基序，MCCv显示纳米尺度结构和长程接触改变，碱基编辑消除CTCF基序后逆转染色质结构；SESN3敲除小鼠HSPC移植显示EAE发病加速；SESN3敲除原代T细胞在饥饿条件下mTOR信号增强；Co-IP显示SESN3与GATOR2互作受色氨酸调节。
- 研究意义
- MCCv平台能够从非编码人类遗传学中大规模鉴定因果变异、基因和通路，为理解自身免疫疾病机制和药物靶点发现提供新方法；SESN3被确定为自身免疫疾病的贡献者，其通过色氨酸感知调控mTOR通路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
IMID GWAS变异优先级筛选与MCCv分析
从免疫介导炎症性疾病相关GWAS信号中鉴定潜在因果变异和靶基因。
从400项研究中输入3,104个独立单倍型，通过六种分子机制（编码、剪接、增强子、CTCF、启动子、UTR）筛选变异，对405个增强子变异在激活的原代CD4+ T细胞中进行MCCv，并使用Micro-C基准比较。
变异对染色质结构影响的单等位基因分析
确定疾病相关变异是否改变纳米尺度染色质结构和长程接触。
对405个顺式调控元件进行MCCv单等位基因分析，使用basepairC统计框架评估等位基因间纳米尺度矩阵差异，并整合RNA-seq进行等位基因表达分析。
rs4409785功能机制解析
揭示rs4409785通过新CTCF基序影响SESN3表达的机制。
对rs4409785进行MCCv纳米尺度足迹和长程接触分析，结合CTCF ChIP-seq、ATAC-seq和H3K27ac ChIP-seq，以及MCCv定相分析超级增强子-启动子接触和等位基因RNA表达。
基因组编辑结合MCCv验证因果性
通过碱基编辑证明CTCF基序的因果作用。
使用BE4max碱基编辑器在rs4409785杂合原代CD4+ T细胞中突变CTCF基序的三个关键碱基，同时设置上游对照gRNA，混合编辑细胞后进行MCCv，解析六种编辑结果。
SESN3体内功能验证
在体内验证SESN3在自身免疫中的作用。
使用Cas9 RNP编辑小鼠HSPC中Sesn3或Rosa26对照，移植到经照射的C57/BL6小鼠，诱导EAE模型，评估临床评分、体重、生存和中枢神经系统浸润T细胞。
SESN3生化机制研究
阐明SESN3调控mTOR信号的分子机制。
在SESN3-FLAG敲入Jurkat细胞中，通过Co-IP检测SESN3与GATOR2亚基WDR59的相互作用，在饥饿条件下添加不同游离氨基酸，Western blot检测mTOR信号标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | ATCC改良Roswell Park Memorial Institute培养基 | Gibco | A1049101 |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| T细胞分离 | Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 18061 |
| CD4+磁珠 | Miltenyi | 130-045-101 | |
| 泛T细胞分离试剂盒 | Miltenyi | 130-096-535 | |
| T细胞培养 | Immunocult-XF T细胞扩增培养基 | STEMCELL Technologies | 10981 |
| Immunocult人CD3, CD28, CD2 T细胞激活剂 | STEMCELL Technologies | 100-0785 | |
| 人白细胞介素-2 | Invitrogen | -- | |
| 3C文库构建 | 甲醛 | Sigma-Aldrich | 47608 |
| 洋地黄皂苷 | Sigma-Aldrich | D-141 | |
| 微球菌核酸酶 | NEB | M0247 | |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸 | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| dNTPs | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| T4多核苷酸激酶PNK | NEB | M0201L | |
| DNA聚合酶I大片段(Klenow) | NEB | M0210L | |
| T4 DNA连接酶 | Thermo Fisher Scientific | EL0013 | |
| QIAGEN DNeasy血液和组织试剂盒 | QIAGEN | 69506 | |
| D1000 Agilent TapeStation | Agilent | 5067-5583 | |
| 测序文库制备 | Ampure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 |
| NEB Ultra II | NEB | 7645S | |
| 捕获杂交 | Roche HyperCapture靶向富集试剂盒 | Roche | 9075828001 |
| 链霉亲和素MyOne C1磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 65001 | |
| RNA提取 | Zymo Direct-zol试剂盒 | Zymo | R2051 |
| RNA-seq | RiboMinus真核系统v2 | Thermo Fisher Scientific | A15020 |
| NEBNext poly(A) mRNA磁分离模块 | NEB | E7490 | |
| NEBNext Ultra II定向RNA文库制备试剂盒（用于Illumina） | NEB | E7760 | |
| 碱基编辑 | P3溶液 | Lonza | V4XP-3032 |
| 小鼠移植 | MOG35-55/CFA乳液试剂盒 | Hooke Lab | EK-2110 |
| 饥饿实验 | ALT-R Cas9 | IDT | 1081058 |
| True-Nuclear转录因子缓冲液套装 | BioLegend | 424401 | |
| 免疫共沉淀 | 抗FLAG M2磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 |
| 2× FLAG肽 | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| Western blot | NuPage Bis-Tris 4–12%凝胶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ECL | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白检测 | ChemiDoc Touch成像仪 | BioRad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MCCv平台验证 | Jurkat细胞系（clone E6-1）、42个杂合获得性功能增强子变异、6个独立MCC文库、短程连接<800 bp、长程连接1 kb-1 Mb 阅读提示：Methods中Cell culture和Manufacture of the 3C library部分；Extended Data Fig. 1 |
| 原代CD4+ T细胞MCCv | 原代CD4+ T细胞来源（3名供体）、激活条件（Immunocult激活剂25 µl/ml + IL-2 10 ng/ml，60小时）、405个顺式调控元件捕获、MCCv数据分析 阅读提示：Methods中Isolation and culture of human T cells和Oligonucleotide hybridization, capture and sequencing部分；Fig. 2c |
| 碱基编辑结合MCCv | 原代CD4+ T细胞（rs4409785杂合供体）、BE4max mRNA 2 µg、sgRNA 100 pmol、电转程序EO-115、编辑效率~50%、6个技术重复、对照gRNA靶向CTCF基序上游~30 bp 阅读提示：Methods中Base editing of primary T cells部分；Fig. 5c,d；Extended Data Fig. 9a |
| 小鼠EAE模型 | C57/BL6小鼠3-4周龄、照射2×5.5 Gy间隔4小时、静脉注射500,000个编辑的CD117+ HSPC、EAE诱导使用MOG35-55/CFA乳液、n=6只/组、临床评分0-4、每日评估 阅读提示：Methods中Mouse transplantation and EAE部分；Fig. 7b；Extended Data Fig. 10c,d |
| SESN3生化机制 | SESN3-FLAG敲入Jurkat细胞、饥饿条件（HBSS 1小时）、游离氨基酸浓度500 µM、Co-IP使用抗FLAG M2磁珠2小时4°C、Western blot使用NuPage Bis-Tris 4-12%凝胶 阅读提示：Methods中Co-immunoprecipitation and western blotting部分；Fig. 7e |