单细胞转录组与细胞通讯分析
绘制肠道IR损伤细胞图谱并筛选中性粒细胞与上皮细胞间关键配体-受体对。
对小鼠IR模型和假手术对照回肠组织进行scRNA-seq，整合公共数据集，使用CellChat分析细胞通讯，识别Thbs1-Cd36信号。
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中性粒细胞-上皮细胞血小板反应蛋白-1-CD36-c-Jun N-末端激酶轴协调肠道缺血再灌注中的黏膜屏障衰竭
A neutrophil-epithelial thrombospondin‑1-CD36-c‑Jun N‑terminal kinase axis orchestrates mucosal barrier failure in intestinal ischemia-reperfusion
实验完整度
高含scRNA-seq、中性粒细胞特异性Thbs1敲除小鼠、CD36与JNK药理学干预、Co-IP、体内外功能验证，覆盖多层级机制。
主要模型
小鼠肠道缺血再灌注模型（45 min缺血/3 h再灌注） MODE-K小鼠小肠上皮细胞系与中性粒细胞Transwell共培养体系 Thbs1flox/flox/Ly6g-CreERT2+中性粒细胞特异性Thbs1敲除小鼠 C57BL/6 WT小鼠及anti-Ly6G中性粒细胞清除模型
重点核对
肠道IR模型为45 min缺血/3 h再灌注 中性粒细胞清除使用anti-Ly6G抗体（克隆1A8）500 μg/20 g体重，于IR前24 h和4 h腹腔注射 CD36抑制剂SSO体内5 mg/kg、术前2周腹腔注射；CD36激动剂oxLDL体内5 mg/kg、术前2 h腹腔注射 JNK抑制剂SP600125体内15 mg/kg、术前2 h腹腔注射；体外10 μM预处理2 h MODE-K与中性粒细胞共培养24 h，中性粒细胞加入量按5×105 cells/well；重组THBS1刺激1 μg/ml、2 h
摘要
背景：肠道缺血再灌注（IR）损伤后的肠道屏障衰竭是驱动致命全身并发症的关键事件；然而，在这些病理条件下调控上皮细胞命运的具体细胞间信号仍未完全清楚。方法：我们对小鼠IR模型的肠道组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），以绘制细胞间通讯网络。通过中性粒细胞特异性血小板反应蛋白-1（Thbs1）敲除小鼠，结合CD36的药理学抑制和激活，以及生化和组织学分析，对识别出的配体-受体对进行功能验证。结果：对IR损伤肠道的scRNA-seq分析揭示了由Thbs1-Cd36配体-受体对介导的关键中性粒细胞-上皮细胞信号通路。中性粒细胞特异性Thbs1基因缺失显著减轻了IR诱导的上皮细胞凋亡和屏障破坏。机制上，THBS1与上皮细胞CD36结合激活JNK信号，介导促凋亡级联反应。CD36抑制具有保护作用，而其激活则绕过对THBS1的需求并引发黏膜损伤。结论：我们的研究阐明了肠道屏障衰竭的关键机制，并将THBS1-CD36-JNK轴确定为减轻烧伤和休克等危重情况下肠道IR损伤的有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肠道缺血再灌注损伤中，浸润中性粒细胞是否通过特定配体-受体信号直接调控肠上皮细胞死亡及黏膜屏障衰竭。
- 核心机制
- 中性粒细胞来源THBS1与上皮细胞CD36结合，激活下游JNK促凋亡信号，介导肠上皮细胞凋亡和屏障破坏；CD36激活可绕过Thbs1缺失，而CD36或JNK抑制可减轻黏膜损伤。
- 主要证据
- scRNA-seq与CellChat识别IR特异性Thbs1-Cd36中性粒细胞-上皮通讯；IF共定位和Co-IP验证THBS1-CD36相互作用；中性粒细胞特异性Thbs1敲除、CD36抑制剂SSO、CD36激动剂oxLDL及JNK抑制剂SP600125在体内和MODE-K共培养体系中验证凋亡、屏障蛋白occludin及p-JNK变化。
- 研究意义
- 研究阐明THBS1-CD36-JNK轴是肠道IR损伤中肠屏障衰竭的可靶向机制，可能为烧伤和休克等危重情况下保护肠黏膜提供潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
中性粒细胞-上皮THBS1-CD36相互作用的定位与生化验证
验证IR条件下中性粒细胞来源THBS1与上皮CD36的空间邻近和物理结合。
对IR组织进行THBS1、Ly6G和CD36免疫荧光共定位；利用Transwell共培养体系进行Co-IP检测THBS1与CD36结合。
中性粒细胞清除及体内结构损伤评估
明确中性粒细胞在IR诱导肠结构损伤、屏障破坏和炎症中的致病作用。
C57BL/6小鼠IR前给予anti-Ly6G抗体清除中性粒细胞，评估肠长、湿干比、H&E、Chiu评分、occludin、IL-6、TNF-α和CD36。
中性粒细胞特异性Thbs1敲除的体内保护验证
验证中性粒细胞来源THBS1对IR诱导肠黏膜损伤的必要性。
使用Thbs1flox/flox/Ly6g-CreERT2+小鼠经他莫昔芬诱导敲除，进行IR处理，分组为NC、IR、T、T+I，评估肠长、湿干比、H&E、Chiu评分、occludin、CD36、IL-6和TNF-α。
体外共培养验证中性粒细胞来源THBS1的细胞毒性
验证IR来源中性粒细胞及中性粒细胞来源THBS1是否直接导致上皮细胞死亡、迁移和屏障功能受损。
将NC、IR、T、T+I组小鼠外周血中性粒细胞与MODE-K细胞共培养24 h，检测活死染色、CCK-8、划痕、occludin IF及Western blot；另用重组THBS1蛋白直接刺激MODE-K。
CD36-JNK通路的体内药理学验证
确定CD36和JNK是否为THBS1诱导上皮凋亡和黏膜损伤的下游必要环节。
建立NC、IR、SSO、T、T+I、oxLDL组及JNK抑制剂组，评估肠长、湿干比、H&E、Chiu评分、occludin、CD36、p-JNK、IL-6、TNF-α以及TUNEL凋亡。
CD36-JNK通路的体外共培养与凋亡验证
验证中性粒细胞来源THBS1通过上皮CD36-JNK轴诱导IER细胞凋亡。
从NC、IR、SSO、T、T+I、oxLDL及JNK抑制剂相关小鼠分离中性粒细胞，与MODE-K共培养24 h，检测CCK-8、划痕、occludin IF、Western blot、Annexin V/PI流式和TUNEL。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因分型 | ProFlex Base PCR仪 | -- | -- |
| Vazyme DL 15000 DNA Marker | Vazyme | MD103 | |
| 中性粒细胞清除 | 抗Ly6G单克隆抗体（克隆1A8） | Bio X Cell | BE0075-1 |
| 流式分析 | PE标记抗小鼠Ly6G抗体 | Biolegend | 127607 |
| FITC标记抗小鼠/人CD11b抗体 | Biolegend | 101206 | |
| BD FACSCanto™ II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 中性粒细胞分离 | 中性粒细胞分离试剂盒 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | P9201 |
| CD36抑制 | 磺基琥珀酰亚胺油酸酯 | MedChemExpress | HY-108309 |
| CD36激活 | 氧化低密度脂蛋白 | Thermo Fisher Scientific | L34357 |
| 氧化低密度脂蛋白 | Yiyuan Biotechnology | -- | |
| THBS1蛋白刺激 | 重组小鼠THBS1蛋白 | R&D Systems | 7859-TH-050 |
| JNK抑制 | SP600125 | TargetMol | T2668 |
| 单细胞测序 | BD Rhapsody™平台 | BD Biosciences | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Clark Bioscience | -- | |
| Co-IP | 抗CD36抗体 | Proteintech | 32731-1-AP |
| 正常兔IgG | Proteintech | 98136-1-RR | |
| Protein A+G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88803 | |
| Western blot | 抗THBS1抗体 | Cell Signaling Technology | 37879 |
| IF | 抗occludin抗体 | Cell Signaling Technology | 91131 T |
| 抗微管蛋白抗体 | HUABIO | M1305-2 | |
| 山羊抗兔IgG (H+L) CoraLite® Plus 488 | Proteintech | RGAR002 | |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L) CoraLite® Plus 594 | Proteintech | RGAM004 | |
| Olympus BX53荧光显微镜 | Olympus | -- | |
| 共聚焦成像 | Leica STELLARIS 5激光扫描共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 肠上皮细胞分离 | CMF-HBSS | KeyGEN | KGL2202-500 |
| EDTA | Beyotime | C0196—100 ml | |
| HEPES | MedChemExpress | HY-D0857 | |
| 流式分析 | APC标记抗小鼠EpCAM抗体 | Biolegend | 118214 |
| PE标记抗小鼠CD45抗体 | Biolegend | 147711 | |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig |
| 抗CD36抗体 | Abmart | T55796 | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2146S | |
| 抗SAPK/JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 T | |
| 抗磷酸化SAPK/JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 4668 T | |
| 抗IL-6抗体 | HUABIO | EM1701-45 | |
| 抗TNF-α抗体 | Proteintech | 80258-6-RR | |
| 抗occludin抗体 | Cell Signaling Technology | 91131 T | |
| 细胞活力检测 | Cell Counting Kit-8试剂盒 | Beyotime | -- |
| CD36抑制剂SSO | MCE | HY-112847A | |
| 吸光度检测 | 酶标仪 | BioTek | Synergy H1 |
| 划痕成像 | 倒置荧光显微镜 | Olympus | IX73 |
| TUNEL检测 | TUNEL检测试剂盒 | Meilunbio | MA0223 |
| 流式凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | KeyGEN BioTECH | -- |
| 细胞消化 | 无EDTA胰酶 | Vicmed | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肠道缺血再灌注模型建立 | 缺血时间45 min、再灌注时间3 h、肠系膜上动脉夹闭方式、小鼠品系与年龄体重 阅读提示：查阅Methods中Experimental animals及Results各体内实验描述，核对IR模型时间点。 |
| 中性粒细胞清除 | anti-Ly6G抗体克隆1A8、剂量500 μg/20 g体重、IR前24 h和4 h腹腔注射、清除效率验证 阅读提示：查阅Methods中Neutrophil depletion model及Figure S4。 |
| 中性粒细胞特异性Thbs1敲除 | Thbs1flox/flox/Ly6g-CreERT2+基因型、他莫昔芬75 mg/kg连续5天、末次注射后7天实验、对照玉米油 阅读提示：查阅Methods中Experimental animals and genotyping及Figure 4a、Figure 6a。 |
| CD36与JNK药理学干预 | SSO体内5 mg/kg术前2周、oxLDL体内5 mg/kg术前2 h、SP600125体内15 mg/kg术前2 h；体外SSO 10 μM或10 μg/ml、oxLDL 20 μg/ml或50 μg/ml、SP600125 10 μM 阅读提示：查阅Methods中Pharmacological interventions、JNK inhibitor treatment和Cell viability assay，注意体内外剂量描述存在差异。 |
| 中性粒细胞-MODE-K共培养 | 中性粒细胞来源分组、共培养24 h、5×105 cells/well、RPMI 1640+10%血清、37°C 5% CO2、Transwell或直接共培养设置 阅读提示：查阅Methods中Neutrophil isolation and coculture、Cell culture and coculture及Figure 3a、Figure 5a、Figure 8a。 |
| 凋亡与屏障功能检测 | TUNEL阳性细胞计数、Annexin V/PI流式凋亡率、occludin IF或Western blot、p-JNK/t-JNK比值、样本量和重复数 阅读提示：查阅Figure 6、Figure 7、Figure 8、Figure 9图注及Methods中Western blot、TUNEL assay、Flow cytometry。 |