GEMM与单细胞图谱构建
表征B7-H3对前列腺肿瘤微环境细胞组分的调控
对PbPP和PbPPCd276小鼠前列腺肿瘤进行scRNA-seq和mIHC，鉴定MDSC和CAF亚群。
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B7-H3-MAPK信号的双重功能通过调控髓源性抑制细胞和成纤维细胞的可塑性协调肿瘤免疫抑制
Dual Functions of B7-H3-MAPK Signaling Orchestrate Tumor Immunosuppression via Regulating the Plasticity of Myeloid-derived Suppressor Cells and Fibroblasts
实验完整度
高包含GEMM、syngeneic模型、scRNA-seq、CyTOF、mIHC及人样本分析等多层级证据，并含功能与机制验证
主要模型
PbPP与PbPPCd276 GEMM前列腺肿瘤模型 DX1同种移植前列腺癌模型 PbPPS GEMM去势抵抗性前列腺癌模型 人前列腺癌单细胞数据集GSE274229
重点核对
PbPPCd276与PbPP GEMM中Cd276敲除后MDSC亚群比例及衰老标志物变化 DX1-sgCtrl与DX1-sgCd276同种移植瘤中Ly6C+或Ly6G+抗体清除对肿瘤生长的影响 B7-H3 mAb（MJ18）联合trametinib在CRPC模型中的剂量、给药途径及生存终点 scRNA-seq和CyTOF分析中MDSC、CAF亚群注释及通路富集结果 人MDSC中B7-H3-MEK-ERK-STAT1轴及SPINK1-EGFR-MEK-ERK轴的验证条件
摘要
B7-H3/CD276是癌症中新兴的免疫治疗靶点。然而，对B7-H3信号及其在调节肿瘤微环境中作用的有限认识阻碍了B7-H3靶向治疗的临床应用。在此，我们报告B7-H3在调节髓源性抑制细胞（MDSC）和癌症相关成纤维细胞（CAF）中发挥双重作用，从而分别促进肿瘤进展和治疗耐药。我们全面表征了B7-H3的一种非经典功能，即在单核细胞MDSC中触发MAPK信号并诱导细胞衰老。衰老的单核M-MDSC分泌趋化因子招募免疫抑制性粒细胞MDSC。B7-H3/Cd276的基因缺失或药理抑制减少了Gr-MDSC并延缓了肿瘤进展。然而，源自MDSC的分泌因子SPINK1补偿性激活CAF中的EGFR/MEK/ERK信号并促进其细胞外基质重塑特征，从而削弱B7-H3靶向免疫治疗。将B7-H3单克隆抗体与FDA批准的MEK抑制剂trametinib联合使用，通过完全减弱免疫抑制机制，在去势抵抗性前列腺癌的临床前模型中显示出持久的抗肿瘤效果。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- B7-H3如何调控肿瘤微环境中的髓源性和基质细胞组分，以及靶向B7-H3治疗耐药的机制是什么？
- 核心机制
- B7-H3直接结合M-MDSC并激活MEK-ERK-STAT1信号诱导其衰老和SASP，分泌CXCL2/3招募Gr-MDSC；同时B7-H3缺失增加非衰老M-MDSC产生SPINK1，激活CAF中EGFR-MEK-ERK信号促进ECM重塑。
- 主要证据
- 在PbPP/PbPPCd276 GEMM和DX1同种移植模型中，通过scRNA-seq、CyTOF、mIHC、流式及体外迁移/共培养实验验证了B7-H3对MDSC和CAF的双重调控。
- 研究意义
- 揭示了B7-H3-MAPK信号在肿瘤免疫抑制中的双重功能，并提供了B7-H3抗体联合MEK抑制剂治疗去势抵抗性前列腺癌的临床前理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MDSC亚群转换及功能验证
验证B7-H3对MDSC亚群比例和肿瘤进展的影响
通过Ly6C/Ly6G抗体清除M-MDSC或Gr-MDSC，注射sgCtrl或sgCd276 DX1细胞，监测肿瘤生长。
B7-H3与M-MDSC结合及衰老诱导
验证B7-H3直接结合M-MDSC并诱导衰老和SASP
分离肿瘤MDSC，与AF647标记的rmB7-H3孵育，流式检测结合；THP-1和人M-MDSC在条件培养基中培养，检测衰老和SASP标志物。
MAPK-STAT1信号机制验证
明确B7-H3诱导M-MDSC衰老的信号通路
使用MEK抑制剂trametinib和ERK抑制剂temuterkib处理M-MDSC，检测衰老、SASP及MAPK磷酸化。
Gr-MDSC招募机制验证
验证衰老M-MDSC通过CXCL-CXCR2轴招募Gr-MDSC
体外迁移实验共培养M-MDSC和中性粒细胞，并使用CXCR2抑制剂AZD-5069进行体内验证。
CAF表型转换及SPINK1-EGFR-MEK-ERK轴验证
验证B7-H3缺失通过MDSC来源SPINK1促进ECM重塑CAF
人成纤维细胞BJ和3T3用rhSPINK1刺激，或用EGFR/MEK/ERK抑制剂处理；hM-MDSC与BJ共培养。
联合治疗体内评估
评估B7-H3抗体联合MEK抑制剂的抗肿瘤效果
在DX1同种移植CRPC模型和PbPPS GEMM中，单用或联用B7-H3 mAb与trametinib，监测肿瘤生长和生存。
人样本临床相关性分析
验证临床前列腺癌样本中B7-H3与MDSC/CAF的关联
分析公共单细胞数据集GSE274229和bulk RNA-seq数据，评估CD276表达与MDSC/CAF特征的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Corning | 10-040-CV |
| 胎牛血清 | Thermo Scientific | 10082147 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Scientific | 15140163 | |
| DMEM培养基 | Corning | 10-013-CV | |
| 支原体检测 | MycoAlert PLUS检测试剂盒 | Lonza | LT07-710 |
| 基因敲除 | 嘌呤霉素 | Thermo Fisher | A1113803 |
| CyTOF | II型胶原酶 | Life Technologies | 17101-015 |
| 布雷菲德菌素A | BioLegend | 420601 | |
| 莫能菌素 | BioLegend | 420701 | |
| TrypLE消化液 | Life Technologies | 12605028 | |
| 红细胞裂解液 | BioLegend | 420301 | |
| CD16/CD32抗体 | BD Biosciences | 553142 | |
| 顺铂 | Fluidigm | 201064 | |
| Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 铱 | Fluidigm | 201192A | |
| MaxPar固定/透化缓冲液 | Fluidigm | 201067 | |
| MDSC分离 | 髓源性抑制细胞分离试剂盒 | Miltenyi | 130-094-538 |
| PBMC分离 | Histopaque-1077分离液 | Sigma-Aldrich | 10771-100ML |
| 单核细胞分离 | MojoSort人CD14+单核细胞分离试剂盒 | BioLegend | 480048 |
| 中性粒细胞分离 | 红细胞裂解液 | BioLegend | 420302 |
| M-MDSC诱导 | GM-CSF | Abnova | P4395 |
| IL-6 | Sino Biological | 10395-HNAE-20 | |
| 单细胞RNA测序 | 胶原酶A | Sigma-Aldrich | 11088793001 |
| BSA组分V | Gibco | 15260037 | |
| 胰蛋白酶 | Corning | 25053CI | |
| 红细胞裂解液 | MACS | 130-094-183 | |
| 牛血清白蛋白 | Ambion | AM2616 | |
| 衰老检测 | C12FDG | Thermo Fisher Scientific | D2893 |
| 流式细胞术 | True-Nuclear转录因子缓冲液套装 | BioLegend | 424401 |
| GolgiPlug蛋白转运抑制剂 | BD Biosciences | 555029 | |
| T细胞分离 | MojoSort小鼠CD4 T细胞分离试剂盒 | BioLegend | 480006 |
| MojoSort小鼠CD8 T细胞分离试剂盒 | BioLegend | 480008 | |
| MojoSort缓冲液 | BioLegend | 480017 | |
| T细胞激活 | Dynabeads小鼠T细胞激活剂CD3/CD28 | Gibco | 11452D |
| T细胞增殖检测 | CellTrace远红细胞增殖试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C34564 |
| MDSC标记 | CellTracker绿色CMFDA染料 | Thermo Fisher Scientific | C7025 |
| 颗粒酶B检测 | PE标记抗人/小鼠颗粒酶B重组抗体 | BioLegend | 372207 |
| 多重免疫组化 | Opal Polaris 7色手动IHC检测试剂盒 | Akoya Biosciences | NEL861001KT |
| Western blot | Laemmli上样缓冲液 | Bio-Rad Laboratories | 1610747 |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | 1620112 | |
| SuperSignal West Femto最高灵敏度底物 | Thermo Scientific | 34095 | |
| 蛋白标记 | Alexa Fluor 647微量蛋白标记试剂盒 | Thermo Scientific | A30009 |
| 重组蛋白 | 重组小鼠B7-H3 | Sino Biological | 50973-M02H |
| 人IgG1-Fc蛋白 | Sino Biological | 10702-HNAH | |
| 细胞染色 | 细胞染色缓冲液 | BioLegend | 420201 |
| RNA提取 | Purelink RNA微量提取试剂盒 | Thermo Scientific | 12183025 |
| 逆转录 | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Life Technologies | 4368813 |
| qPCR | PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Scientific | A25778 |
| 细胞处理 | 曲美替尼 | MedChemExpress | HY-10999 |
| temuterkib | MedChemExpress | HY-101494 | |
| 阿法替尼 | MedChemExpress | HY-10261 | |
| 重组蛋白 | 重组人SPINK1蛋白 | MedChemExpress | HY-P71053 |
| 小鼠SPINK1蛋白 | MedChemExpress | HY-P702493 | |
| 抗体中和 | 抗SPINK1单克隆抗体 | Boca Scientific | PSKAN2 |
| 体内治疗 | 抗B7-H3单克隆抗体 | Bio X Cell | BE0124 |
| IgG对照 | Bio X Cell | BE0290 | |
| PXS-5505 | MCE | HY-138625B | |
| 维莫德吉 | MCE | HY-10440 | |
| AZD-5069 | MCE | HY-19855 | |
| 体内清除 | 抗Ly6C单克隆抗体 | BioXCell | BE0203 |
| 抗Ly6G单克隆抗体 | BioXCell | BE0075-1 | |
| 抗CD4单克隆抗体 | BioXCell | BE0003-1 | |
| 抗CD8单克隆抗体 | BioXCell | BE0061 | |
| 抗NK1.1单克隆抗体 | BioXCell | BE0036 | |
| 同型对照 | 小鼠IgG | BioXCell | BE0093 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GEMM模型构建与scRNA-seq | PbPP与PbPPCd276小鼠月龄（5个月）、样本量（PbPP 7只合并为5样本，PbPPCd276 3只/3样本） 阅读提示：Methods中GEM models部分及Figure 1A图注 |
| MDSC体内清除实验 | 抗体剂量（200 μg/次，i.p.）、处理频率（每两天）、DX1细胞注射量（1×10^6） 阅读提示：Methods中In vivo MDSC depletion assay及Figure 1H图注 |
| B7-H3结合与衰老诱导实验 | rmB7-H3-hFc-AF647孵育条件（4°C，1小时）、rhB7-H3浓度（5或10 μg/mL）、处理时间（48小时） 阅读提示：Methods中B7-H3 recombinant protein conjugation and binding assay及Figure 2A-2K图注 |
| MAPK抑制剂处理实验 | trametinib浓度（0.25 μM）、temuterkib浓度（5 μM）、处理时间（48小时） 阅读提示：Methods中Cell treatment in vitro及Figure 3C-3F图注 |
| 联合治疗体内实验 | B7-H3 mAb剂量（300 μg/次，i.p.，每3天）、trametinib剂量（3 mg/kg，口服，隔天）、enzalutamide饮食 阅读提示：Methods中Combination treatment in syngeneic and GEM models of CRPC及Figure 5A、5F图注 |
| CXCR2抑制剂体内实验 | AZD-5069剂量（100 mg/kg，口服，每日）、处理时间（3周） 阅读提示：Methods中CXCR2 inhibitor treatment in syngeneic models |
| CAF清除实验 | PXS-5505剂量（20 mg/kg，i.p.，每日周一至周五）、Vismodegib剂量（40 mg/kg，口服灌胃，每日周一至周五） 阅读提示：Methods中In vivo CAF depletion assay |