患者hiPSC系建立与基因编辑
获得携带DEPDC5杂合及双等位基因突变的等基因hiPSC系以模拟FCDII。
从两名男性受试者外周血单核细胞重编程获得hiPSC，使用CRISPR-Cas9将p.L1420Ffs*154突变引入患者DEPDC5+/− hiPSC的第二等位基因，并在hTIGRE位点插入CAG-EGFP-pA构建体。
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嵌合人皮质类器官通过DEPDC5缺失模拟mTOR相关局灶性皮质发育不良
Mosaic human cortical organoids model mTOR-related focal cortical dysplasia through DEPDC5 deletion
实验完整度
高含患者来源hiPSC、嵌合hCOs体外模型、电生理记录和单细胞转录组学，并有功能与机制验证。
主要模型
患者来源DEPDC5+/− hiPSC系 嵌合型人皮质类器官（含DEPDC5+/−和DEPDC5−/−细胞） DEPDC5−/− 等基因hiPSC系
重点核对
Mos High hCOs中约50%的DEPDC5−/−细胞，Mos Low hCOs中15%–20%的DEPDC5−/−细胞 6个月hCOs在缺乏亮氨酸和精氨酸的培养基中孵育4小时，Western blot检测pS6水平 从Day 25起使用20 nM雷帕霉素或溶剂对照处理hCOs并检测pS6 6个月全hCOs使用64通道MEA记录3分钟，分析活跃电极数和放电频率 对1、3、6个月hCOs进行scRNA-seq，每种条件5个hCOs/文库
摘要
局灶性皮质发育不良II型（FCDII）是儿童药物难治性局灶性癫痫的主要原因，由mTOR通路基因的脑体细胞变异引起，包括mTOR抑制因子DEPDC5的种系和体细胞二次打击功能丧失变异。在此，我们提出了一个使用患者来源的人皮质类器官（hCOs）的DEPDC5二次打击失活嵌合概念验证模型。嵌合hCOs显示mTOR活性增加，可被mTOR抑制剂雷帕霉素挽救。嵌合hCOs还表现出畸形样神经元和增强的神经元兴奋性，重现了FCDII的关键病理特征。跨三个发育阶段的单细胞转录组学揭示了导致上层神经元过早生成的异常分化轨迹，神经祖细胞中Notch和Wnt信号通路上调，以及兴奋性神经元中突触和癫痫相关基因表达改变。此外，我们在嵌合DEPDC5二次打击hCOs中识别出代谢和翻译的细胞自主改变。本研究为DEPDC5缺陷如何扰动人类皮质发生提供了新见解，强调该基因的嵌合双等位基因失活是FCDII发病机制所必需的。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DEPDC5杂合与双等位基因失活在FCDII发病和癫痫发生中的相对贡献是什么？
- 核心机制
- DEPDC5双等位基因失活导致GATOR1介导的mTORC1抑制受损，引起mTOR通路组成性激活，进而扰乱皮质发生并增加神经元兴奋性。
- 主要证据
- 嵌合hCOs中pS6水平在氨基酸剥夺下维持不变，雷帕霉素可降低pS6；EGFP+ DEPDC5−/−神经元胞体增大、SMI311积累；scRNA-seq显示上层神经元过早生成及Notch/Wnt通路失调；MEA记录显示嵌合hCOs活跃电极数和放电频率增高。
- 研究意义
- 本研究提供了DEPDC5缺陷扰动人类皮质发生的机制见解，表明嵌合双等位基因失活是FCDII发病所必需的，为未来识别治疗靶点奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
人皮质类器官生成与嵌合体制备
在体外重现人类皮质发育并模拟DEPDC5嵌合状态。
hiPSC经定向分化方案形成hCOs；将EGFP+ DEPDC5−/−与EGFP− DEPDC5+/−细胞按比例混合形成嵌合hCOs，设置高嵌合（约50% DEPDC5−/−）和低嵌合（15%–20% DEPDC5−/−）两水平。
mTOR通路活性检测
验证DEPDC5缺失是否导致mTORC1组成性激活。
对6个月hCOs进行氨基酸剥夺（缺乏亮氨酸/精氨酸）4小时，Western blot检测pS6；对3个月hCOs进行雷帕霉素处理，免疫荧光定量pS6；在Mos Low hCOs中比较EGFP+和EGFP−神经元的pS6水平。
细胞形态与病理特征分析
检测DEPDC5双等位基因失活是否产生FCDII标志性畸形神经元。
对6个月Mos Low hCOs进行EGFP、NeuN和SMI311共免疫染色，定量EGFP+与EGFP−神经元的胞体大小和SMI311强度；vimentin染色检测气球样细胞。
单细胞转录组学与轨迹分析
解析DEPDC5缺失对皮质发育轨迹和细胞类型组成的影响。
对1、3、6个月的CT、Het和Mos hCOs进行scRNA-seq，使用Seurat分析细胞类型组成，scVelo进行RNA velocity分析，ClusterProfiler进行GO富集。
神经电生理功能验证
评估DEPDC5嵌合是否导致神经元网络兴奋性增高。
使用64通道MEA系统记录6个月全hCOs的自发放电活动，分析活跃电极数和放电频率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | mTeSR™1培养基 | Stem Cell Technologies | -- |
| Vitronectin XF™ | Stem Cell Technologies | -- | |
| 层粘连蛋白-521 | -- | -- | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | -- | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | -- | |
| 类器官分化 | Neurobasal™-A | Life Technologies | -- |
| dorsomorphin | -- | -- | |
| SB-431542 | -- | -- | |
| XAV-939 | -- | -- | |
| FGF2/EGF | -- | -- | |
| BDNF/NT-3 | -- | -- | |
| 氨基酸剥夺 | 缺乏亮氨酸/精氨酸的SILAC Neurobasal培养基 | Athena Enzyme Solutions | -- |
| mTOR抑制 | 雷帕霉素 | -- | -- |
| Western blot | NuPAGE™凝胶 | Invitrogen | -- |
| β-Actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| β-Actin抗体 | Sigma-Aldrich | A2066 | |
| DEPDC5抗体 | Abcam | ab213181 | |
| DEPDC5抗体 | Abcam | ab185565 | |
| 免疫荧光 | DLK1抗体 | Abcam | ab21682 |
| BLBP抗体 | Abcam | ab32423 | |
| GFP抗体 | Aves Labs | GFP-1020 | |
| GFP抗体 | Invitrogen | A-6455 | |
| NeuN抗体 | Millipore | MAB377 | |
| NeuN抗体 | Millipore | ABN78 | |
| 磷酸化S6核糖体蛋白（Ser240/244）抗体 | Cell Signaling Technology | 5364 | |
| SATB2抗体 | Abcam | ab51502 | |
| 神经丝SMI311抗体 | BioLegend | BLE837801 | |
| SOX2抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-9811-82 | |
| SOX2抗体 | Millipore | AB5603 | |
| S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2317S | |
| ZO-1抗体 | Thermo Fisher Scientific | 33-9100 | |
| ZO-1抗体 | Cell Signaling Technology | 13663S | |
| 抗兔免疫球蛋白G HRP偶联二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| MEA记录 | MED64多电极阵列系统 | Alpha MED Scientific | -- |
| scRNA-seq | 10× Genomics Chromium Next GEM单细胞3′试剂盒v.3.1 | 10× Genomics | -- |
| eFluor 660活力染料 | Invitrogen | -- | |
| Illumina NovaSeq6000 | Illumina | -- | |
| 免疫染色 | RapiClear | -- | -- |
| DAPI | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 嵌合hCOs制备 | DEPDC5−/−与DEPDC5+/−细胞混合比例：Mos High约50%，Mos Low 15%–20% 阅读提示：参见Materials and methods中Human cortical organoid generation小节 |
| mTOR通路活性检测 | 氨基酸剥夺时间（4小时）、培养基类型（缺乏亮氨酸/精氨酸的SILAC Neurobasal）、细胞年龄（6个月） 阅读提示：参见Materials and methods中Human cortical organoid generation和Western blotting小节，以及Figure 1C图注 |
| 雷帕霉素处理 | 处理浓度（20 nM）、起始时间（Day 25）、溶剂对照（乙醇） 阅读提示：参见Materials and methods中Human cortical organoid generation小节，以及Figure 1D图注 |
| MEA记录 | 记录时间（3分钟）、细胞年龄（6个月）、活跃电极定义（≥5 spikes/min） 阅读提示：参见Materials and methods中Multielectrode array recordings小节，以及Figure 6D图注 |
| scRNA-seq | 每文库hCOs数量（5个）、各条件批次数、总分析细胞数 阅读提示：参见Materials and methods中Single-cell RNA sequencing小节，以及Figure 2A图注 |