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        靶向KIT可预防由ALK1缺陷型血管生成内皮细胞驱动的脑动静脉畸形

        Targeting KIT prevents brain arteriovenous malformations driven by ALK1-deficient angiogenic endothelial cells

        作者信息Elise Drapé, Lauranne Carrier, Gael Cagnone, Atik Rm Fuad, Mathilde Bizou, Damian A Sanchez, Typhaine Anquetil, Jack Wang, Halima Drissi Touzani Walali, Adnan Gopinadhan, Patrick Piet van Vliet, Joel P Howard, Mysha Ibnat, Gregor Andelfinger, Ethan Winkler, Bruno Larrivée, Alexandre Dubrac
        PMID42579368
        期刊J Clin Invest
        发布时间2026-08-11
        DOI10.1172/JCI197587
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含Alk1iECKO小鼠模型、区域分辨scRNA-seq、人类AVM样本验证、体外细胞实验及体内药物验证等多层级证据

        主要模型

        Alk1iECKO小鼠（EC特异性诱导性Alk1敲除小鼠） 人脑内皮细胞（HBECs） 人脐静脉内皮细胞（HUVECs） 人HHT2及散发性bAVM患者脑组织样本

        重点核对

        Alk1iECKO小鼠在P6注射tamoxifen（15 μg）诱导Alk1缺失，P8分析血管表型 Imatinib mesylate（100 mg/kg）、masitinib mesylate（100 mg/kg）和KIT-blocking antibody（500 μg）在P6 tamoxifen注射后3小时及P7腹腔注射 EdU（30 mg/kg）在处死前3小时腹腔注射，用于增殖检测 HUVECs和HBECs转染ALK1 siRNA，48小时后用BMP9（5 ng/mL或20 ng/mL）处理24小时 scRNA-seq每个实验四库（Alk1l/l PNVP、Alk1l/l INVP、Alk1iECKO PNVP、Alk1iECKO INVP）

        摘要

        遗传性出血性毛细血管扩张症2型（HHT2）由ACVRL1（又称ALK1）突变引起，以脑动静脉畸形（bAVMs）为特征，即动脉-静脉异常连接，治疗选择仍然有限。尽管有证据表明内皮细胞（EC）存在异质性，但其在bAVM发病机制中的作用仍不明确。我们使用EC特异性诱导性Alk1敲除小鼠（Alk1iECKO）和区域分辨的单细胞RNA测序，发现ALK1信号缺失主要在神经周围血管丛中诱导bAVM。该过程由具有人类AVM样转录特征的KIT+血管生成EC群体的出现所驱动，包括尖端细胞标志物以及PI3K和KRAS信号通路的激活。跨物种分析和对人类样本的验证表明，KIT表达在散发性和HHT2型bAVM的EC中均保守。药物重定位分析确定KIT为最重要的可操作靶点，我们证明Kit直接受BMP9/ALK1/SMAD4信号抑制。药理学抑制KIT可减少体内血管生成重编程和血管畸形，而不影响正常血管。这些发现确定了一种致病性血管生成EC状态，并将KIT信号定位为bAVM中具有治疗可操作性的通路。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        内皮细胞异质性在HHT2相关脑动静脉畸形（bAVM）发病机制中的作用是什么？
        核心机制
        ALK1信号缺失诱导KIT+血管生成内皮细胞群体出现，该群体具有尖端细胞标志物和PI3K/KRAS信号通路激活；BMP9/ALK1/SMAD4信号直接抑制Kit转录，KIT信号促进血管生成重编程和血管畸形形成。
        主要证据
        在Alk1iECKO小鼠中，PNVP区域出现血管畸形和AV连接，scRNA-seq鉴定出血管生成2簇（KIT+），跨物种分析显示与人bAVM内皮细胞共享标志物，体外实验证实ALK1/SMAD4敲低增加KIT表达，KIT抑制剂（masitinib、imatinib、KIT-blocking antibody）减轻血管畸形和血管生成重编程。
        研究意义
        识别了bAVM相关的致病性血管生成内皮细胞状态，将KIT信号定位为bAVM的潜在治疗靶点，提示KIT抑制剂可能对HHT相关和散发性bAVM具有治疗价值。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        Alk1iECKO小鼠模型建立与血管表型分析

        验证ALK1信号缺失是否诱导脑动静脉畸形，并确定病变区域

        在P6注射tamoxifen诱导EC特异性Alk1敲除，P8通过CD31和α-SMA免疫染色分析PNVP和INVP的血管形态、血管面积、直径及AV连接

        2

        单细胞RNA测序分析内皮细胞异质性

        揭示ALK1缺失诱导的内皮细胞转录组异常和异质性

        分离PNVP和INVP区域的内皮细胞进行scRNA-seq，使用Seurat进行聚类和UMAP可视化，VISION进行通路活性评分，Monocle3进行轨迹分析

        3

        血管生成2簇的鉴定与特征分析

        表征ALK1缺失诱导的血管生成内皮细胞簇及其与人类bAVM的相似性

        通过标记基因表达、通路富集分析、配体-受体连接组分析、跨物种比较和ISH验证，鉴定血管生成2簇的特征

        4

        体外验证ALK1/SMAD4对KIT的调控

        验证BMP9/ALK1/SMAD4信号是否直接调控KIT表达

        在HUVECs和HBECs中转染control或ALK1 siRNA，用BMP9处理，通过Western blot和RT-qPCR检测KIT表达；SMAD4 siRNA敲低后检测KIT表达

        5

        药理学抑制KIT的体内验证

        评估KIT抑制对血管畸形和血管生成重编程的影响

        在tamoxifen注射同时给予KIT抑制剂（masitinib、imatinib、KIT-blocking antibody），P8分析PNVP血管形态、EC增殖、基因表达和生存率

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        免疫荧光染色原位杂交单细胞RNA测序
        验证细胞功能变化
        EdU掺入实验细胞增殖实验
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹逆转录定量PCR批量RNA测序
        验证机制链路
        siRNA敲低配体-受体连接组分析轨迹分析通路活性评分分析
        评估体内效果
        Kaplan-Meier生存分析药物重定位分析
        数据分析与统计
        Seurat分析Monocle3分析Connectome分析limma-voom分析edgeR分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        动物实验他莫昔芬SigmaT5648
        甲磺酸伊马替尼SelleckchemS1026
        甲磺酸马赛替尼CedarlaneE0814
        KIT阻断抗体BioXCellBE0293-5MG-A
        InVivoMAb大鼠IgG2b同型对照BioXCellBE0090-5MG-A
        增殖检测EdULife TechnologiesA10044
        Click-iT EdU细胞增殖试剂盒InvitrogenC10340
        组织通透Triton X-100SigmaX100-500ML
        组织封闭牛血清白蛋白BioshopALB001.100
        驴血清Thermo Fisher Scientific56-646-05ML
        组织包埋OCT包埋剂Thermo Fisher Scientific23-730-571
        蔗糖Thermo Fisher ScientificBP220 1
        核染色DAPISigmaD9542
        封片封片剂Sigma81381-50G
        脑组织解离神经组织解离试剂盒(P)Miltenyi Biotec130-092-628
        细胞过滤40 μm细胞筛网Falcon352340
        细胞分离碎片去除液Miltenyi Biotec130-109-398
        红细胞裂解液Miltenyi Biotec130-094-183
        流式分析PE抗小鼠CD140b抗体BioLegend136006
        APC偶联抗小鼠CD31抗体BD Biosciences551262
        FITC偶联抗小鼠CD45抗体BioLegend103108
        Live/Dead可固定Aqua死细胞染色剂Thermo Fisher ScientificL34957
        流式分选BD FACSAria Fusion流式细胞分选仪BD--
        scRNA-seqChromium单细胞3'试剂盒v3.110x Genomics--
        Illumina NovaSeq6000 S4测序仪Illumina--
        免疫荧光ERG123抗体Abcamab92513
        ISHSuperfrost Plus显微镜载玻片Thermo Fisher Scientific12-550-15
        RNAscope探针----
        Leica TCS SP8激光扫描共聚焦显微镜Leica--
        人免疫荧光Podocalyxin抗体R&D SystemsAF1658-SP
        CD117/c-KIT抗体AgilentA450229-2
        Alexa Fluor 555驴抗兔Thermo Fisher ScientificPIA32794
        Alexa Fluor 647驴抗羊Thermo Fisher ScientificPIA32849
        苏丹黑Thermo Fisher ScientificBP109-10
        抗淬灭封片剂Vector LaboratoriesH-1700-10
        Eclipse Ti2显微镜Nikon Instruments--
        细胞培养人脐静脉内皮细胞Promo CellC-12203
        人脑内皮细胞Cell SystemsACBRI 376
        EBM2基础培养基LonzaCC-3121
        SingleQuots添加剂LonzaCC-4133
        细胞转染Lipofectamine RNAiMAX转染试剂Invitrogen13778150
        细胞处理BMP9R&D Systems3209-BP-010
        内皮细胞分离CD31抗体BD Pharmingen550274
        Dynabeads磁珠Thermo Fisher Scientific11035
        DynaMag-15磁力架Thermo Fisher Scientific12301D
        脑组织消化胶原酶/中性蛋白酶Sigma11097113001
        DNase ISigmaDN25
        TLCKSigmaT7254
        40 μm细胞筛网Thermo Fisher Scientific087711
        RNA提取Monarch总RNA小量提取试剂盒New England BiolabsT2010S
        肺组织消化I型胶原酶WorthingtonLS004196
        70 μm细胞筛网Thermo Fisher Scientific087712
        细胞培养胎牛血清Thermo Fisher Scientific12484028
        I型胶原蛋白Thermo Fisher ScientificA1064401
        嘌呤霉素Santa Cruz BiotechnologySC-108071A
        RT-qPCRiScript逆转录预混液Bio-Rad1708841
        iQ SYBR Green预混液Bio-Rad1708882
        Western blotLaemmli缓冲液4×Bio-Rad1610747
        NuPAGE MES SDS电泳缓冲液20×Thermo Fisher ScientificNP0002
        硝酸纤维素膜Bio-Rad1620112
        SuperSignal West Femto最高灵敏度底物Thermo Fisher Scientific34096
        Clarity Western ECL底物Bio-Rad1705060S
        ChemiDoc MP成像系统Bio-Rad--

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        Alk1iECKO小鼠模型建立
        tamoxifen剂量（15 μg）、注射时间（P6）、分析时间点（P8）、基因型（Alk1l/l × Cdh5CREERT2）
        阅读提示：Methods中Animal models and experiments部分
        单细胞RNA测序
        细胞分选策略（CD45-CD31+）、测序平台（10x Genomics Chromium v3.1）、测序深度（~144,000 reads/cell）、数据分析参数（Seurat V5，resolution 1.2，top 3000 variable genes）
        阅读提示：Methods中Brain preparation for scRNA-seq部分
        KIT抑制剂体内处理
        药物剂量（imatinib 100 mg/kg，masitinib 100 mg/kg，KIT抗体500 μg）、给药时间（P6 tamoxifen后3小时及P7）、给药途径（腹腔注射）、对照（DMSO或PBS/isotype control）
        阅读提示：Methods中Animal models and experiments部分及Figure 6A
        体外细胞实验
        细胞类型（HUVECs和HBECs）、siRNA转染后时间（48小时）、BMP9浓度（5 ng/mL或20 ng/mL）、处理时间（24小时）
        阅读提示：Methods中HUVECs and HBECs' culture部分及Figure 5
        人类样本验证
        样本来源（UCSF神经外科手术患者）、抗体（podocalyxin 1:100，CD117/c-KIT 1:100）、抗原修复条件（pH 9，85°C 15分钟）
        阅读提示：Methods中Human immunofluorescence staining部分

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