纳米抗体免疫与噬菌体展示筛选
获得靶向IL-18Rα和IL-18Rβ的高亲和力纳米抗体家族
用纯化的IL-18Rα或IL-18Rβ抗原免疫三只双峰驼，构建免疫纳米抗体噬菌体展示库，经生物淘选和流式细胞术筛选结合细胞表面抗原的克隆，测序并基于CDR3分型。
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纳米抗体工程化双特异性IL-18模拟物通过结合CD8+ T细胞并规避IL-18BP在临床前模型中驱动抗肿瘤免疫
Nanobody-engineered bispecific IL-18 mimetics drive antitumor immunity by engaging CD8+ T cell and evading IL-18BP in preclinical models
实验完整度
高包含PBMC、CD8+ T细胞体外功能验证、RNA-seq机制分析及CDX/PDX体内模型，含CD8+ T细胞清除验证。
主要模型
健康供体外周血单个核细胞（PBMCs）及分离的CD8+ T细胞 PK-59细胞系来源异种移植（CDX）huPBMC-NCG小鼠模型 H23细胞系来源异种移植（CDX）huPBMC-NCG小鼠模型 两例患者来源异种移植（PDX）肺癌huPBMC-NCG小鼠模型
重点核对
A4B2-mdFc单药剂量：0.37、1.86、9.32 mg/kg，腹腔注射每周两次共3周；IL-18对照0.32 mg/kg PDX模型A4B2-mdFc剂量1.86 mg/kg，腹腔注射每3天一次共6次；anti-CD8抗体10 mg/kg，于A4B2-mdFc前1天给药 联合治疗剂量：anti-PD-1（nivolumab）5 mg/kg，anti-CTLA-4（ipilimumab）5 mg/kg，A4B2-mdFc 1.86 mg/kg RNA-seq处理条件：CD8+ T细胞经isotype、10 nM IL-18、10 nM IL-18+100 nM IL-18BP、10 nM A4B2-mdFc、10 nM A4B2-mdFc+100 nM IL-18BP处理24小时，含10 ng/mL human IL-12 IFN-γ释放筛选条件：1 nM抗体+10 ng/mL human IL-12，孵育17–24小时；PBMC 200,000细胞/孔
摘要
细胞因子在癌症免疫治疗中具有前景，但其多效性限制了特异性和临床应用。通过与IL-18Rα和IL-18Rβ结合，白细胞介素-18（IL-18）刺激先天淋巴细胞和效应T细胞以发挥抗肿瘤免疫。然而，重组IL-18的临床试验受到IL-18结合蛋白（IL-18BP）的阻碍，这是一种分泌的高亲和力诱饵受体。在此，我们开发了保持IL-18信号传导潜力的抗诱饵双特异性纳米抗体。基于靶向IL-18Rα和IL-18Rβ的激动性纳米抗体，双特异性纳米抗体A4B2-mdFc有效增强了CD8+ T细胞反应，并具有独特的转录组谱。系统性递送A4B2-mdFc增强了CD8+ T细胞浸润和活化，在细胞系来源异种移植和患者来源异种移植模型中表现出剂量依赖性的抗肿瘤疗效。有趣的是，当用A4B2-mdFc处理时，CD8+ T细胞上的PDCD1和CTLA4表达急剧增加。注射A4B2-mdFc显著提高了靶向PD-1和CTLA-4的免疫检查点抑制剂（ICIs）的抗肿瘤疗效。我们的发现表明，基于纳米抗体的双特异性IL-18模拟物通过CD8+ T细胞活化和IL-18BP抗性引发了优越的抗肿瘤活性，为细胞因子靶向双特异性纳米抗体单药治疗或与ICIs联合用于癌症免疫治疗提供了潜在应用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过纳米抗体工程化构建靶向IL-18Rα和IL-18Rβ的双特异性IL-18模拟物，在规避IL-18BP抑制的同时有效激活CD8+ T细胞并产生抗肿瘤疗效？
- 核心机制
- A4B2-mdFc作为双特异性IL-18模拟物，同时结合IL-18Rα和IL-18Rβ，模拟IL-18信号传导，增强CD8+ T细胞反应并抵抗IL-18BP的诱饵抑制。
- 主要证据
- 在PBMC和CD8+ T细胞中，A4B2-mdFc诱导IFN-γ释放并激活免疫相关通路，且IL-18BP不影响其转录组；在PK-59和H23 CDX及两例肺癌PDX模型中，A4B2-mdFc剂量依赖性抑制肿瘤生长并增加CD8+ T细胞浸润，该疗效在CD8+ T细胞清除后完全消失。
- 研究意义
- 提供了一种可规避IL-18BP抑制的IL-18模拟物，具有作为单药或与抗PD-1/抗CTLA-4免疫检查点抑制剂联合用于癌症免疫治疗的潜在应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
纳米抗体亲和力与结合活性表征
评估筛选获得的纳米抗体对人和食蟹猴IL-18Rα/IL-18Rβ的亲和力及细胞表面结合能力
通过ELISA、表面等离子共振（SPR）和流式细胞术检测9个抗IL-18Rα纳米抗体家族和15个抗IL-18Rβ纳米抗体家族与hIL-18Rα/hIL-18Rβ及CynoIL-18Rα/CynoIL-18Rβ蛋白及过表达293T细胞的结合。
双特异性抗体构建与活性筛选
筛选能有效诱导IFN-γ释放的最佳双特异性纳米抗体构型
将9个抗IL-18Rα纳米抗体与15个抗IL-18Rβ纳米抗体进行组合融合，连接至人IgG1 Fc，构建270种双特异性抗体，通过PBMC IFN-γ释放实验筛选，并优化连接子长度和Fc修饰。
A4B2-mdFc体外CD8+ T细胞反应及IL-18BP抗性验证
验证A4B2-mdFc激活CD8+ T细胞的转录组特征及其规避IL-18BP抑制的能力
从PBMC分离CD8+ T细胞，分别用isotype、IL-18、IL-18+IL-18BP、A4B2-mdFc、A4B2-mdFc+IL-18BP处理，进行RNA-seq、差异表达基因分析、PCA、热图、KEGG/GO富集和GSEA。
CDX模型抗肿瘤疗效及CD8+ T细胞浸润评估
评估A4B2-mdFc单药在细胞系来源异种移植模型中的剂量依赖性抗肿瘤效果及CD8+ T细胞浸润
建立PK-59和H23 huPBMC-NCG CDX模型，随机分组给予isotype、IL-18或A4B2-mdFc三个剂量，监测肿瘤生长、肿瘤重量，免疫荧光检测hCD8阳性细胞浸润。
PDX模型抗肿瘤疗效及CD8+ T细胞依赖性验证
在患者来源异种移植模型中评估A4B2-mdFc疗效并验证CD8+ T细胞的关键作用
建立两例肺癌PDX模型，给予isotype、A4B2-mdFc或A4B2-mdFc+anti-CD8抗体，监测肿瘤生长，流式细胞术检测CD8+ T细胞和IFN-γ+CD8+ T细胞浸润。
A4B2-mdFc联合免疫检查点抑制剂疗效评估
评估A4B2-mdFc与anti-PD-1或anti-CTLA-4联合治疗是否增强抗肿瘤效果及安全性
在PK-59 CDX模型中，分组给予isotype、A4B2-mdFc、anti-PD-1、anti-CTLA-4、A4B2-mdFc+anti-PD-1、A4B2-mdFc+anti-CTLA-4，监测肿瘤生长和重量，检测血清ALT/AST/ALP及主要器官H&E。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | BasalMedia | L220KJ |
| 胎牛血清 | BasalMedia | ST30-3302 | |
| ELISA | 抗HA.11表位标签抗体 | BioLegend | 901524 |
| TMB溶液 | Biopanda Diagnostics | TMB-S-004 | |
| IFN-γ释放实验 | 人IL-12 | -- | IL2-H5210 |
| IFN-γ检测试剂盒 | MultiSciences | EK180HS | |
| RNA-seq | CD8+ T细胞分离试剂盒 | BioLegend | 480012 |
| TruSeq RNA样本制备试剂盒 | -- | -- | |
| 动物实验 | 基质胶 | Yeasen | 40183ES08 |
| 免疫荧光 | 抗人CD8抗体 | Servicebio | GB114123 |
| 异硫氰酸荧光素标记二抗 | Servicebio | GB25303 | |
| 流式分析 | 抗CD45抗体 | BioLegend | 304028 |
| 抗CD3抗体 | BioLegend | 300440 | |
| 抗CD8抗体 | BioLegend | 300926 | |
| 抗人IFN-γ抗体 | BioLegend | 506506 | |
| 动物实验 | 抗CD8抗体 | Bio X Cell | BE0004-2 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 纳米抗体免疫与筛选 | 免疫动物数量（三只双峰驼）、抗原剂量（1 mg/次）、免疫次数（7次，每周一次）、淘选轮数（IL-18Rα 3轮，IL-18Rβ 4轮） 阅读提示：Methods 'Preparation and screening of anti-IL-18Rα or anti-IL-18Rβ nanobody candidates'及Figure 1 |
| 双特异性抗体构建与IFN-γ释放筛选 | 抗体浓度（1 nM）、IL-12浓度（10 ng/mL）、PBMC数量（200,000/孔）、孵育时间（17–24 h）、阳性对照（1 nM IL-18，0.1 nM DR-18）、连接子长度及Fc修饰 阅读提示：Methods 'IFN-γ release assay'及Figure 3 |
| CD8+ T细胞RNA-seq | 细胞处理浓度（10 nM IL-18或A4B2-mdFc，100 nM IL-18BP）、IL-12浓度（10 ng/mL）、孵育时间（24 h）、RNA质量标准、测序平台 阅读提示：Methods 'RNA-seq analysis'及Figure 4 |
| CDX模型单药治疗 | 细胞接种数量（1×10^8）、Matrigel比例（50%）、PBMC回输数量（5×10^6）、肿瘤体积分组标准（约100 mm³）、剂量（0.37/1.86/9.32 mg/kg及IL-18 0.32 mg/kg）、给药频率（每周两次，共3周）、终点时间（PK-59第21天，H23第25天） 阅读提示：Methods 'Tumor treatment'及Figures 5和6 |
| PDX模型及CD8+ T细胞清除 | PDX传代（P3用于正式实验）、PBMC回输数量（5×10^6）、肿瘤体积分组标准（50–100 mm³）、每组鼠数（5只）、A4B2-mdFc剂量（1.86 mg/kg）及给药频率（每3天一次共6次）、anti-CD8剂量（10 mg/kg）及给药时间（A4B2-mdFc前1天） 阅读提示：Methods 'Tumor treatment'及Figure 7 |
| 联合治疗及安全性评估 | A4B2-mdFc剂量（1.86 mg/kg）、anti-PD-1（nivolumab）和anti-CTLA-4（ipilimumab）剂量（5 mg/kg）、给药频率（每周两次共3周）、血清ALT/AST/ALP检测时间（每周）、主要器官H&E 阅读提示：Methods 'Tumor treatment'及Figure 8、Figures S14–S16 |