缺氧性CA9高表达间充质样胶质瘤干细胞促进复发性胶质母细胞瘤中ANXA1-FPR1依赖性巨噬细胞极化

背景：复发性胶质母细胞瘤（rGBM）的特征是显著髓系重塑和深度免疫抑制微环境。尽管碳酸酐酶9（CA9）是与侵袭性胶质母细胞瘤（GBM）行为相关的经典缺氧诱导分子，但其在rGBM中的细胞状态特异性分布及其在胶质瘤干细胞（GSC）-巨噬细胞串扰中的作用仍不完全清楚。方法：我们整合了公共转录组队列、单细胞RNA测序、定量蛋白质组学、配对临床标本以及体外/体内功能实验，以确定CA9在rGBM中的作用。在单细胞分辨率下解析恶性细胞状态和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）亚群，并通过计算推断细胞间通讯。在GBM细胞系和患者来源GSC中建立CA9功能获得和缺失模型。通过qRT-PCR、Western blotting、ELISA和启动子报告基因实验评估ANXA1表达和分泌。使用条件培养基转移、重组ANXA1挽救和环孢素H药理学FPR1阻断评估巨噬细胞极化。结果：CA9在GBM中上调，在间充质和复发性肿瘤中进一步富集，并与较差生存相关。单细胞分析将CA9主要定位在一个缺氧相关的MES样GSC亚群，该亚群在复发性样本中扩增并表现出升高的干性。复发性肿瘤还显示SPP1+免疫抑制性TAM增加。蛋白质组学、转录组学和细胞-细胞通讯分析优先将ANXA1作为具有分泌性免疫调节潜力的CA9相关下游介质。缺氧诱导CA9和ANXA1，缺氧反应元件的突变减弱了ANXA1启动子激活。CA9敲低降低了ANXA1表达和分泌，损害了GBM生长表型，并减弱了缺氧驱动的ANXA1诱导。CellChat突出了复发性GBM中缺氧MES样GSC与SPP1+TAM之间增强的信号传导，提名ANXA1-FPR1作为领先的配体-受体轴。在功能上，CA9高表达GBM细胞的条件培养基促进M2样巨噬细胞极化，该作用被CA9敲低减弱，被重组ANXA1部分恢复，并被FPR1拮抗显著抑制，支持ANXA1作为贡献性旁分泌介质，并被FPR1拮抗显著抑制。在体内，CA9敲低以及在CA9完整肿瘤中FPR1阻断，减少了M2样巨噬细胞相关信号。结论：CA9在rGBM中富集于缺氧MES样GSC，并促进支持免疫抑制性巨噬细胞极化的ANXA1依赖性旁分泌程序。这些发现确定了一个CA9-ANXA1-FPR1相关的神经免疫串扰轴，将缺氧干细胞样肿瘤状态与复发性GBM中的髓系重塑联系起来，其中ANXA1作为贡献性旁分泌介质而非CA9驱动的免疫抑制的唯一效应器。