筛选内源基因UTR
鉴定在呼吸道上皮细胞中高表达且能增强IVT mRNA翻译的UTR序列。
利用Human Protein Atlas数据，筛选在肺细胞类型中高表达基因的5'和3'UTR，构建编码荧光素酶的mRNA，在多种细胞中评估翻译效率。
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气道应用的mRNA疫苗需要量身定制的序列设计和高标准纯化，以去除破坏性的dsRNA污染物
Airway-applied mRNA vaccine needs tailored sequence design and high standard purification that removes devastating dsRNA contaminant
实验完整度
高包含体外细胞筛选、小鼠体内成像与免疫评估、dsRNA回加和RNA-seq等多层级功能与机制验证。
主要模型
BALB/c小鼠经吸入(i.h.)给药模型 BALB/c小鼠经肌肉注射(i.m.)给药模型 16HBE人支气管上皮细胞 DC2.4小鼠骨髓来源树突状细胞
重点核对
mRNA的5'和3'UTR序列设计（TB-Opti vs BNT） mRNA纯化方法（LiCl沉淀 vs 亲和色谱纯化） dsRNA污染物含量（<0.5% vs >99.5%去除） 给药途径：吸入(i.h.) vs 肌肉注射(i.m.)
摘要
黏膜mRNA疫苗的开发前景广阔但极具挑战性。主要研究努力集中在优化递送系统上，但mRNA组分的内在质量是否显著影响气道接种的mRNA疫苗效力仍属未知。在此，我们系统证明，与胃肠外途径接种的对应疫苗相比，黏膜mRNA疫苗需要更高标准的纯化和量身定制的序列设计才能发挥效力。双链RNA（dsRNA）污染物容易在气道中触发先天免疫反应，激活mRNA降解机制，从而降低mRNA表达和随后的抗原特异性免疫反应。为应对这些挑战，我们开发了一种策略，将从肺细胞内源基因筛选得到的优化非翻译区（UTR）与基于亲和色谱的纯化相结合，有效去除dsRNA污染物。经气道途径给药的优化mRNA不仅在肺部表现出卓越的蛋白表达（提高30倍）和减轻的炎症，还促进了强大的适应性免疫，包括显著升高的系统性、细胞和黏膜免疫反应。这与肌肉注射对应物形成鲜明对比，后者效果不明显。我们的发现从优化mRNA组分这一被忽视但关键的视角，为黏膜mRNA疗法的开发提供了新见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- mRNA分子自身的内在质量（序列设计和纯度）是否以及如何影响气道接种的mRNA疫苗效力。
- 核心机制
- dsRNA污染物在气道中触发TLR3、RIG-I、MDA-5等dsRNA传感器介导的先天免疫反应，激活OAS/RNase L通路导致mRNA降解，从而抑制抗原表达和免疫反应。
- 主要证据
- 通过体外细胞实验、小鼠体内成像和免疫实验证明；dsRNA回加实验证实其抑制作用（i.h.途径损失98.8%功能）。
- 研究意义
- 强调mRNA组分质量对呼吸道应用的重要性，提出将肺特异性UTR设计与亲和色谱纯化相结合，为下一代黏膜mRNA疫苗的开发提供策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
优化TMSB10 UTR序列
通过删除miRNA靶点和插入功能元件，提升TMSB10 UTR驱动的mRNA翻译效率。
预测并删除TMSB10 3'UTR中miRNA靶点，在5'UTR插入Apt-eIF4G，3'UTR插入R3U元件，构建优化UTR组合。
体外和体内验证序列优化效果
评估TB-Opti序列在体外细胞和体内通过不同接种途径的表达和免疫原性。
将编码荧光素酶或RBD的mRNA包封于LNP，通过i.h.或i.m.途径接种小鼠，监测生物发光信号和抗原特异性免疫反应。
亲和色谱纯化IVT mRNA
开发并表征一种去除IVT mRNA污染物（主要是dsRNA）的纯化方法。
采用oligo(dT)18亲和色谱柱，通过不同缓冲液系统去除杂质，并用琼脂糖凝胶电泳和dot blot验证纯度和dsRNA去除率。
评估纯化对体外细胞表达和安全性的影响
比较纯化前后IVT mRNA在培养细胞中的表达效率、细胞毒性和炎症因子分泌变化。
将纯化前后的mRNA用不同转染试剂转染多种细胞，检测荧光素酶表达、细胞活力、IFN-α/β和IL-6分泌水平。
评估纯化对体内蛋白表达的影响
比较纯化前后LNP-mRNA经i.h.或i.m.给药后的全身及肺部蛋白表达情况。
将纯化或未纯化的mFluc-LNP通过不同途径注射小鼠，进行活体及离体器官生物发光成像。
dsRNA回加验证机制
确认dsRNA是造成i.h.途径表达抑制的主要因素及其机制。
在纯化mRNA中加入1.0% (w/w) dsRNA，通过i.h.或i.m.途径给药，观察表达变化及免疫相关基因表达，并通过RT-qPCR和RNA-seq进行分析。
免疫效果评估
评估纯化mRNA疫苗在不同途径免疫后诱导的体液、细胞和黏膜免疫反应。
用纯化或未纯化的mRBD-LNP免疫小鼠，检测血清IgG、BALF/NLF sIgA、T细胞反应及中和抗体。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与处理 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 链霉素 | Gibco | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | -- | |
| Opti-MEM I减血清培养基 | Invitrogen Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 转染 | Lipo8000转染试剂 | Beyotime | -- |
| 聚乙烯亚胺 | MKBio | -- | |
| IVT mRNA合成 | T7高产RNA转录试剂盒 | Novoprotein Scientific | -- |
| N1-甲基假尿苷三磷酸 | Glycogene | -- | |
| IVT mRNA加帽 | CleanCap三核苷酸帽1类似物 | Yeasen Biotechnology | -- |
| Cap 1加帽系统 | Novoprotein Scientific | M082-01B | |
| IVT mRNA纯化 | oligo(dT)18亲和色谱柱 | Sartorius | -- |
| 高效液相色谱系统 | Agilent | 1260 | |
| 真空浓缩仪 | JM Technology | CV200 | |
| mRNA-LNP制备 | 微流控设备 | ACMEI LIFESCIENCE | -- |
| D-Lin-MC3-DMA脂质 | Shanghai Advanced Vehicle Technology | -- | |
| 二硬脂酰磷脂酰胆碱 | Avanti | -- | |
| 胆固醇 | Avanti | -- | |
| DMG-PEG-2000 | Avanti | -- | |
| LNP表征 | Zetasizer Nano ZS粒度仪 | Malvern Instruments | -- |
| RiboGreen荧光染料 | Invitrogen | -- | |
| 透射电子显微镜 | -- | -- | |
| 表达检测 | 萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Beyotime | RG005 |
| 微板发光检测仪 | Promega | GloMax Navigator | |
| 倒置荧光显微镜 | Nikon | ECLIPSE T | |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Cell Signaling Technology | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗SARS-CoV-2刺突蛋白RBD单克隆抗体 | Solarbio | K200105M | |
| 山羊抗小鼠IgG1 HRP标记二抗 | Abcam | ab97240 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 14C10 | |
| 细胞活力 | CCK8溶液 | MedChem Express | -- |
| 细胞因子检测 | 小鼠IFN-α ELISA试剂盒 | ruixinbio | RX203124M |
| 小鼠IFN-β ELISA试剂盒 | ruixinbio | RX203106M | |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | ruixinbio | RX203049M | |
| BMDC分化与成熟 | 白细胞介素-4 | PeproTech | 214-14 |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | 315-03 | |
| 流式分析 | 可固定活力染料700 | BD Biosciences | 564997 |
| 抗小鼠CD11c抗体 | Biolegend | 117317 | |
| 抗小鼠CD80抗体 | BioLegend | 104722 | |
| 抗小鼠CD86抗体 | Invitrogen | 17-0862-81 | |
| MHC II类(I-A/I-E)抗体 | Invitrogen | 48-5321-82 | |
| 抗小鼠IFN-γ抗体 | Thermo Fisher Scientific | 12-7311-82 | |
| 抗小鼠CD3e抗体 | BD Biosciences | 553061 | |
| 抗小鼠CD4抗体 | BD Biosciences | 550954 | |
| 抗小鼠CD8a抗体 | BioLegend | 100722 | |
| 抗小鼠CD44抗体 | BioLegend | 103012 | |
| 抗小鼠CD62L抗体 | BioLegend | 161204 | |
| 抗小鼠CD69抗体 | BioLegend | 104527 | |
| 抗小鼠CD103抗体 | BioLegend | 121423 | |
| ELISA | 山羊抗小鼠IgG-HRP偶联物 | Abcam | ab97023 |
| 山羊抗小鼠IgA-HRP偶联物 | Abcam | ab97235 | |
| TMB底物 | Abcam | ab171522 | |
| ELISpot | 胶原酶II | Solarbio | C8150 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Diamond | B002138-0100 | |
| Percoll分离液 | GE Healthcare | 17-0891-09 | |
| 红细胞裂解液 | Tiangen | RT122-02 | |
| 小鼠IFN-γ/IL-4/IL-17A ELISpot PLUS试剂盒 | MabTech | 3321-4AST-2/3311-4APW-2/3521-4HPW-2 | |
| ELISpot读板仪 | AID | -- | |
| 细胞内因子染色 | Cytofix/Cytoperm试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
| D-荧光素 | -- | -- | |
| 活体成像 | 活体成像系统 | PerkinElmer | Lumina Series III |
| RT-qPCR | MicroElute总RNA提取试剂盒 | OMEGA | R6731-01 |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara | RR037B | |
| Hieff SYBR Green Master Mix试剂盒 | YEASEN | 11201ES08 | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | -- | -- |
| dsRNA制备 | T7 RNA聚合酶2.0 | Novoprotein Scientific | -- |
| 2× Fast Pfu Master Mix | Novoprotein Scientific | -- | |
| dsRNA检测 | dsRNA DIBA试剂盒 | Novoprotein Scientific | RD009 |
| dsRNA特异性抗体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| mRNA序列设计 | 5'UTR和3'UTR来源（TMSB10）及优化（miRNA结合位点删除、Apt-eIF4G和R3U插入）、mRNA编码序列、poly(A)尾长度（110 nt） 阅读提示：Methods: IVT mRNA; Figure 1 |
| mRNA合成 | 转录试剂盒（T7 High Yield RNA Transcription Kit）、核苷酸修饰（N1-Methyl-Pseudo-UTP）、加帽方式（酶促加帽）、纯化方法（LiCl沉淀和亲和色谱） 阅读提示：Methods: IVT mRNA, Affinity chromatography purification |
| LNP制备 | 脂质组成及摩尔比例（i.m. 50:10:38.5:1.5；i.h. 46:23:30:1）、N/P比（8:1）、水相/有机相体积比（1:3）、微流控设备 阅读提示：Methods: Preparation of mRNA-LNP formulations; Figure 3F |
| 动物实验 | 小鼠品系（BALB/c，雌性，6-8周龄）、给药途径（i.h.或i.m.）、剂量（3 μg或1 μg）、给药体积（50 μL）、给药时间点（0、21天） 阅读提示：Methods: Animals, Mouse immunization regimen; Figure 7 |
| dsRNA回加实验 | dsRNA长度（500 bp）、加入比例（1.0% w/w） 阅读提示：Methods: Bioluminescence imaging; Figure 6G |