构建AR小鼠模型并验证
建立DerP1诱导的AR小鼠模型,并验证模型成功。
使用DerP1鼻内刺激C57BL/6小鼠,通过行为学(鼻抓挠次数)、血清IgE、IL-4、IL-5水平及鼻黏膜组织病理染色评估模型。
Interleukin 1β Mediates the Pathogenesis of Nasal Mucosal Epithelial Barrier Dysfunction in Allergic Rhinitis.
包含DerP1诱导的AR小鼠模型和人鼻黏膜上皮细胞体外实验两个独立证据层级,并进行了IL-1β直接刺激和抑制剂干预的功能验证及机制验证。
C57BL/6小鼠AR模型(DerP1诱导) 人鼻黏膜上皮细胞(HNEpCs) CD4+ T细胞
小鼠模型:6-8周龄雄性C57BL/6小鼠,DerP1致敏(第1天1μg,第8-12天10μg/天,鼻内给药) 细胞实验:HNEpCs用DerP1(40 µg/mL)或IL-1β(10 pg/mL)处理24小时 抑制剂处理:Diacerein(50 µM)、AF12198(10 nM)、Belnacasan(50 µM)预处理2小时 CD4+ T细胞用IL-1β(10 pg/mL)刺激24小时,AF12198(10 nM)预处理
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立DerP1诱导的AR小鼠模型,并验证模型成功。
使用DerP1鼻内刺激C57BL/6小鼠,通过行为学(鼻抓挠次数)、血清IgE、IL-4、IL-5水平及鼻黏膜组织病理染色评估模型。
验证AR小鼠鼻黏膜上皮屏障是否受损。
通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光检测紧密连接蛋白CLDN1和OCLN的表达水平。
检测AR小鼠鼻黏膜中IL-1β表达变化及其与屏障指标的相关性。
通过RT-qPCR和Western blot检测IL-1β和IL-1RA的表达,并进行相关性分析。
验证DerP1刺激人鼻黏膜上皮细胞后IL-1β表达和屏障变化。
用DerP1刺激HNEpCs 24小时,检测IL-1β、IL-1RA、CLDN1和OCLN的表达。
确定IL-1β是否直接导致HNEpCs屏障损伤。
用人IL-1β(10 pg/mL)刺激HNEpCs 24小时,检测CLDN1和OCLN表达,并与DerP1刺激组比较。
验证IL-1β通过IL-1R1损伤屏障的作用。
在DerP1刺激前用IL-1β抑制剂Diacerein或IL-1R1抑制剂AF12198预处理HNEpCs,检测CLDN1和OCLN表达。
探索IL-1β在AR中除屏障外的免疫调节作用。
用IL-1β刺激CD4+ T细胞,检测IL-4、IL-5、IL-13分泌,并用AF12198抑制IL-1R1观察效果。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型构建 | DerP1 | Greer | XPB91D3A2.5 |
| 细胞培养 | MEM培养基 | BioInd | C3050 |
| 胎牛血清 | BioInd | C04001 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Beyotime | C0222 | |
| 药物处理 | 白细胞介素-1β | Sino | 10139-HNAE |
| 双醋瑞因 | MCE | HY-N0283 | |
| AF12198 | MCE | HY-P1110 | |
| Belnacasan | MCE | HY-13205 | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Cellmax | CGM112.05 |
| T细胞激活 | 人CD3/CD28 T细胞激活剂 | Stemcell | 10971 |
| ELISA | 小鼠IgE ELISA试剂盒 | Neobioscience | EMC117.96 |
| 小鼠IL-4 ELISA试剂盒 | Neobioscience | EMC003.96 | |
| 小鼠IL-5 ELISA试剂盒 | Neobioscience | EMC108.96 | |
| 人IL-1β ELISA试剂盒 | Neobioscience | EHC002b.96 | |
| 人IL-4 ELISA试剂盒 | ABclonal Biotechnology Co., Ltd. | RK00003 | |
| 人IL-5 ELISA试剂盒 | ABclonal Biotechnology Co., Ltd. | RK00033 | |
| 人IL-13 ELISA试剂盒 | ABclonal Biotechnology Co., Ltd. | RK00034 | |
| Multiskan FC酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 组织病理 | 石蜡 | Leica | -- |
| 显微镜DMLB2 | Leica | -- | |
| 免疫荧光 | CLDN1抗体 | Proteintech | 13050-1-AP |
| OCLN抗体 | Beyotime | AF7644 | |
| YF®488山羊抗兔IgG | UELandy | Y6105 | |
| DAPI | Beyotime | C1005 | |
| 抗淬灭封片剂 | Solarbio | S2130 | |
| Axio Observer 7显微镜 | Carl Zeiss AG | -- | |
| RT-qPCR | VeZol试剂 | Vazyme | R411-01 |
| HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 试剂盒 | Vazyme | R223-01 | |
| ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒 | Vazyme | Q321-02 | |
| FTC-3000P系统 | Funglyn Biotech | -- | |
| 引物 | Sangon Biotech | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0020 |
| BCA试剂盒 | Sparkjade | EC0001 | |
| 蛋白上样缓冲液 | Solarbio | P1040 | |
| CLDN1抗体 | Proteintech | 13050-1-AP | |
| OCLN抗体 | Beyotime | AF7644 | |
| IL-1β抗体 | Abcam | ab254360 | |
| IL-1RA抗体 | Beyotime | AF7218 | |
| 微管蛋白抗体 | Proteintech | 10068-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Beyotime | AF1186 | |
| CASP1抗体 | Proteintech | 22915-1-AP | |
| IL-18抗体 | Proteintech | 10663-1-AP | |
| 吐温-20 | Beyotime | ST825 | |
| 山羊抗兔IgG | UELandy | H6162 | |
| 山羊抗小鼠IgG | UELandy | H6161 | |
| 增强化学发光试剂盒 | Sparkjade | ED0015 | |
| ChemiScope6200 Touch | Clinx | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | 小鼠品系、性别、年龄、体重;DerP1致敏剂量、时间、给药方式;对照组处理 阅读提示:参见Materials and Methods中Animals和Dermatophagoides Pteronyssinus 1 (DerP1)-Induced Mice Model of AR and Behavioral Tests部分 |
| 细胞模型 | HNEpCs来源;培养基成分;DerP1和IL-1β处理浓度、时间;抑制剂类型、浓度、预处理时间 阅读提示:参见Materials and Methods中Culture and Treatment of Human Nasal Epithelial Cells (HNEpCs) and T Cells部分 |
| 检测方法 | RT-qPCR引物序列、内参基因;Western blot抗体稀释度、内参;ELISA试剂盒型号和检测蛋白 阅读提示:参见Materials and Methods中RT-qPCR、Western Blot Analysis和ELISA部分 |
| 统计设计 | 样本量(动物n、细胞实验重复数);统计方法(t检验、one-way ANOVA);显著性阈值 阅读提示:参见Materials and Methods中Statistical Analysis部分及图注 |