测定NaB对THP-1细胞的细胞毒性
确定不影响细胞活力的NaB安全浓度范围，为后续实验选择剂量。
THP-1细胞在不同浓度NaB（0-50 mM）下培养24小时，用MTS法检测细胞活力。
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丁酸钠通过调节抗菌肽（LL37）表达和NF-κB信号通路抑制牛分枝杆菌的生长和致病性
Sodium Butyrate Abrogates the Growth and Pathogenesis of Mycobacterium bovis via Regulation of Cathelicidin (LL37) Expression and NF-κB Signaling.
实验完整度
高包含体外THP-1细胞感染模型（MTS、CFU、qPCR、Western blot、ELISA）和体内小鼠感染模型（CFU、组织病理、存活率），并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
THP-1细胞（PMA诱导分化的巨噬细胞样细胞） C57BL/6小鼠牛分枝杆菌感染模型
重点核对
NaB处理浓度：0.5 mM和1.0 mM（体外）；500 mg/kg（体内，腹腔注射） 感染复数（MOI）：10:1 感染时间：3小时（体外）；小鼠感染后处理，观察至第7周 细胞系：THP-1细胞（来自协和医科大学细胞中心） 小鼠品系：C57BL/6，感染剂量200 CFU，鼻内途径
摘要
牛分枝杆菌是牛结核病的病原体，已被确定为对人类群体的严重威胁。研究发现，丁酸钠（NaB）作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可以促进抗菌肽（LL37）的表达并帮助机体抵抗多种损伤。在本研究中，我们探讨了NaB在调控宿主防御机制抵抗牛分枝杆菌感染中的治疗作用。我们发现，在牛分枝杆菌感染的THP-1细胞中，NaB处理后LL37的表达增加。相反，NaB处理显著下调了感染牛分枝杆菌的THP-1细胞中I类HDAC的表达。此外，NaB降低了磷酸化P65（p-P65）和p-IκBα的表达，表明抑制了核因子-κB（NF-κB）信号通路。进一步，我们发现NaB处理减少了牛分枝杆菌感染的THP-1细胞中炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-10）和关键抗凋亡标志蛋白Bcl-2的产生。值得注意的是，小鼠在NaB处理后对牛分枝杆菌感染表现出高抵抗力。存活牛分枝杆菌杆菌的减少表明NaB诱导的牛分枝杆菌感染抑制由LL37上调和NF-κB信号通路抑制介导。这些观察表明NaB介导针对牛分枝杆菌感染的保护性免疫反应。总的来说，这些结果表明NaB可作为控制动物和人类牛分枝杆菌感染的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 丁酸钠（NaB）能否通过调节LL37表达和NF-κB信号通路抑制牛分枝杆菌的生长和致病性？
- 核心机制
- NaB通过上调抗菌肽LL37的表达，并抑制NF-κB信号通路的激活（降低p-P65和p-IκBα水平），从而增强巨噬细胞的杀菌能力并减轻炎症反应。
- 主要证据
- 体外实验中，NaB处理显著减少THP-1细胞内存活牛分枝杆菌数量，增加LL37表达，降低HDAC1/2/3和p-P65、p-IκBα水平，减少炎症因子分泌；体内实验中，NaB处理减轻小鼠肺脾病变，降低组织载菌量，提高存活率（65% vs 35%）。
- 研究意义
- NaB可作为控制动物和人类牛分枝杆菌感染的辅助治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估NaB对胞内牛分枝杆菌存活的影响
验证NaB是否能增强巨噬细胞清除牛分枝杆菌的能力。
THP-1细胞感染牛分枝杆菌后，用NaB（0.5和1.0 mM）处理24小时，通过CFU计数测定细菌数量。
检测NaB对LL37表达的影响
探究NaB是否促进抗菌肽LL37的转录和翻译。
感染牛分枝杆菌的THP-1细胞经NaB处理后，用qRT-PCR和Western blot检测LL37的mRNA和蛋白水平。
分析NaB对I类HDAC表达的影响
验证NaB抑制HDAC的作用是否在蛋白水平上体现。
感染牛分枝杆菌的THP-1细胞经NaB处理后，用Western blot检测HDAC1、HDAC2和HDAC3的蛋白水平。
评估NaB对NF-κB信号通路的影响
探究NaB是否抑制由牛分枝杆菌激活的NF-κB信号通路。
感染牛分枝杆菌的THP-1细胞经NaB处理后，用Western blot检测P65、p-P65、IκBα和p-IκBα的表达。
检测NaB对凋亡相关蛋白的影响
探究NaB是否通过调节凋亡相关蛋白影响细胞凋亡。
感染牛分枝杆菌的THP-1细胞经NaB处理后，用Western blot检测Bcl-2和Bax的表达。
检测NaB对炎症细胞因子分泌的影响
探究NaB是否抑制牛分枝杆菌诱导的炎症反应。
感染牛分枝杆菌的THP-1细胞经NaB处理后，用ELISA检测细胞上清中IL-1β、IL-10和TNF-α的水平。
评估NaB对小鼠牛分枝杆菌感染的疗效
验证NaB在体内对牛分枝杆菌感染的保护作用。
C57BL/6小鼠感染牛分枝杆菌后，腹腔注射NaB（500 mg/kg）或PBS，观察体重、器官系数、组织病理、CFU和存活率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素 | Gibco | -- | |
| 链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞分化 | 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | P8139 |
| 细菌培养 | Middlebrook 7H9肉汤 | Difco | -- |
| 白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶 | -- | -- | |
| 吐温-80 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | MTS试剂盒 | -- | -- |
| 细胞裂解 | Triton X-100 | -- | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA浓度检测 | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Scientific | -- |
| cDNA合成 | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Fermentas | -- |
| qRT-PCR | AceQ qRT-PCR SYBR Green Master Mix | Vazyme Biotech | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | Beyotime Ltd. | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore Corporation | -- |
| 抗LL37抗体 | Abcam | ab180760 | |
| 抗Tublin-α抗体 | -- | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗IκBα抗体 | Proteintech | 10268-1-AP | |
| 抗P65抗体 | Proteintech | 10745-1-AP | |
| 抗HDAC3抗体 | Proteintech | 10255-1-AP | |
| 抗Bcl2抗体 | Proteintech | 12789-1-AP | |
| 抗Bax抗体 | Proteintech | 50599-2-lg | |
| 抗磷酸化NF-κB P65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗磷酸化IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 9246 | |
| 抗HDAC1抗体 | Cell Signaling Technology | 34589 | |
| 抗HDAC2抗体 | Cell Signaling Technology | 57156 | |
| HRP标记的二抗 | Proteintech | -- | |
| ECL底物 | -- | -- | |
| Bio-Rad成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| ELISA | IL-1β、IL-10、TNF-α ELISA试剂盒 | Neobioscience | -- |
| 酶标仪 | Thermo Scientific | Multiskan FC | |
| 动物实验 | C57BL/6小鼠 | SPF Biotechnology | -- |
| 组织学 | Ziehl–Neelsen染色 | -- | -- |
| 图像分析 | Image-Pro宏软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与分化 | 细胞系（THP-1）、培养基（RPMI 1640）、血清（10% FBS）、PMA浓度（10 ng/ml）和分化时间（48小时） 阅读提示：Materials and Methods: Cell Culture |
| 细菌培养与感染 | 菌株（M. bovis C68004）、培养基（7H9、ADC、丙酮酸钠、Tween-80）、MOI（10:1）、感染时间（3小时） 阅读提示：Materials and Methods: Bacterial Culture and Infection |
| 药物处理 | NaB浓度（体外0.5和1.0 mM，体内500 mg/kg）、给药途径（体内腹腔注射）、给药频率（每2天） 阅读提示：Materials and Methods: Cell Viability Assay; Mice Model of M. bovis Infection |
| 细胞活力检测 | 细胞密度（1x10^4/孔）、MTS试剂盒、孵育时间（4小时）、检测波长（450 nm） 阅读提示：Materials and Methods: Cell Viability Assay |
| 菌落计数 | 裂解液（0.2% Triton X-100）、稀释涂板（7H11琼脂）、培养时间（2-3周） 阅读提示：Materials and Methods: Colony-Forming Units Assay |
| 基因表达检测 | 引物序列（CAMP、GAPDH）、qRT-PCR试剂盒、仪器（ViiA7）、相对定量方法（2^-ΔΔCt） 阅读提示：Materials and Methods: Quantitative Real-Time PCR |
| 蛋白表达检测 | 裂解液（RIPA）、抗体列表（LL37、HDAC1/2/3、NF-κB相关、Bcl-2、Bax）、内参（GAPDH或Tublin-α） 阅读提示：Materials and Methods: Western Blot Assay |
| 细胞因子检测 | ELISA试剂盒（Neobioscience）、检测指标（IL-1β、IL-10、TNF-α）、样品（细胞上清） 阅读提示：Materials and Methods: ELISA for Cytokines |
| 动物模型 | 小鼠品系（C57BL/6）、感染剂量（200 CFU）、感染途径（鼻内）、给药方案（500 mg/kg腹腔注射，每2天）、观察时间点（3、5、7周） 阅读提示：Materials and Methods: Mice Model of M. bovis Infection |
| 组织病理学 | 组织固定（10%甲醛）、包埋切片、染色方法（H&E、ZN）、观察指标（病变面积、炎症浸润） 阅读提示：Materials and Methods: Histopathological Examination |