CypD表达上调分析
验证CypD在ALD患者和小鼠模型中的表达变化及其与疾病进展的相关性。
通过NIAAA模型比较健康与ALD小鼠的线粒体形态和关键线粒体蛋白表达；利用临床队列和免疫组化分析CypD在ALD患者肝脏中的表达；分析单细胞RNA测序数据确定Ppif的细胞类型定位。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
环亲素D抑制的临床前候选药物改善酒精相关性肝损伤
A preclinical candidate of cyclophilin D inhibition improves alcohol-associated liver injury.
实验完整度
高包含肝细胞特异性敲除和过表达小鼠模型、体外细胞实验、体内药效实验、生物物理结合实验、ADMET及I期临床试验等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
NIAAA慢性-暴饮乙醇喂养小鼠模型（C57BL/6J） 肝细胞特异性CypD敲除小鼠（CypDΔHep） AAV8介导的肝细胞CypD过表达小鼠 AML12肝细胞和RAW264.7巨噬细胞
重点核对
RN-0001给药剂量：10 mg/kg，腹腔注射，每日一次 乙醇喂养方案：Lieber-DeCarli液体饲料含5%乙醇10天，第16天5 g/kg乙醇灌胃，9小时后处死 NIAAA模型中CRV431给药剂量：50 mg/kg，每日一次，灌胃 体外乙醇损伤模型：RAW264.7条件培养基加50 mM乙醇处理AML12 CypD敲除小鼠基因型：Alb-Cre+ PpifF/F
摘要
Che等人表明，环亲素D促进酒精相关性肝病中的线粒体功能障碍和肝损伤。在乙醇喂养的小鼠中，肝细胞CypD缺失或RN-0001治疗可减少脂肪变性、炎症和氧化应激。ADMET分析和首次人体I期临床试验支持RN-0001的安全性和转化潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 环亲素D（CypD）在酒精相关性肝病（ALD）进展中是否起关键作用，以及CypD抑制剂RN-0001能否作为治疗ALD的临床前候选药物？
- 核心机制
- 乙醇诱导的线粒体氧化应激触发CypD依赖性mPTP开放，导致线粒体膜电位丧失、ATP耗竭和细胞死亡；CypD抑制可阻断这一过程。
- 主要证据
- 肝细胞特异性CypD敲除减轻乙醇诱导的线粒体功能障碍、脂肪变性、炎症和氧化应激；RN-0001直接结合CypD（MST和SPR）并在体内外保护肝损伤，且在CypD缺陷小鼠中保护作用消失。
- 研究意义
- 研究支持RN-0001作为ALD治疗的临床前候选药物，其安全性和耐受性在I期临床试验中得到初步验证，为后续II期试验提供了依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肝细胞特异性CypD敲除的功能验证
评估肝细胞特异性CypD缺失对乙醇诱导的肝损伤、脂肪变性、炎症和线粒体功能障碍的影响。
将CypDf/f和CypDΔHep小鼠进行NIAAA模型处理，检测血清ALT、AST、TG、TC、TNF-α和IL-6水平，肝组织H&E和油红O染色，以及线粒体功能相关蛋白表达。
CypD对线粒体通透性转换和线粒体功能的影响
探究CypD缺失是否通过调节mPTP开放和线粒体钙稳态来改善线粒体功能。
分离肝线粒体，测定钙诱导的线粒体肿胀、钙保留能力、耗氧率、膜电位变化、ATP产生和线粒体ROS水平。
CypD过表达对肝损伤的影响
验证CypD过表达是否加重乙醇诱导的线粒体应激和肝损伤。
通过尾静脉注射AAV8-CypD构建肝细胞特异性CypD过表达小鼠，进行NIAAA模型处理，检测血清生化、肝脏组织学、线粒体形态和ROS。
RN-0001的药理特性评价
评估RN-0001对CypD的抑制作用、选择性和药代动力学特征。
通过PPIase活性测定计算Ki值，检测对钙调磷酸酶活性的影响，测定钙保留能力（EC50）和IL-2释放（EC50）；在大鼠中进行药代动力学研究。
RN-0001在体外细胞模型中的保护作用
评估RN-0001对乙醇诱导的肝细胞损伤的保护作用，并确认其通过CypD介导。
在AML12和RAW264.7细胞模型中，使用不同浓度RN-0001处理，检测细胞活力、LDH释放、凋亡、脂质积累和炎症因子表达；通过siRNA敲低和过表达CypD验证其靶点。
RN-0001与CypD的结合模式分析
通过分子对接、分子动力学模拟和生物物理实验验证RN-0001与CypD的直接结合。
使用分子对接和200 ns MD模拟分析结合模式，通过MST和SPR测定结合亲和力。
RN-0001在小鼠ALD模型中的体内疗效
评估RN-0001对酒精性肝损伤的治疗效果，并验证其作用依赖于CypD。
对C57BL/6J和CypDf/f、CypDΔHep小鼠进行NIAAA模型处理，给予RN-0001，检测血清生化、组织学、线粒体形态等。
RN-0001的安全性评价
评估RN-0001的长期毒性和I期临床安全性。
在健康小鼠中进行90天长期给药试验，检测体重、脏器指数、组织学和血清生化；进行IND-enabling GLP毒性研究（大鼠、犬）；进行首次人体I期临床试验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
临床安全性评估
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 抗线粒体融合蛋白1抗体 | Abcam | ab221661 |
| 抗线粒体融合蛋白2抗体 | Abcam | ab124773 | |
| 抗细胞色素C抗体 | Abcam | ab133504 | |
| 抗Nrf2抗体 | Abcam | ab92946 | |
| 抗SOD1抗体 | Abcam | ab16831 | |
| 抗过氧化氢酶抗体 | Abcam | ab52477 | |
| 抗CYP2E1抗体 | Abcam | ab28146 | |
| 抗DRP1抗体 | Cell Signaling Technology | 8570 | |
| 抗FIS1抗体 | Cell Signaling Technology | 32525 | |
| 抗OPA1抗体 | Cell Signaling Technology | 80471 | |
| 抗Bcl-2抗体 | Cell Signaling Technology | 3498 | |
| 抗Bax抗体 | Cell Signaling Technology | 2772 | |
| 抗PCNA抗体 | Cell Signaling Technology | 13110 | |
| 抗iNOS抗体 | Cell Signaling Technology | 13120 | |
| 抗裂解型Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 抗NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 抗磷酸化NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗磷酸化Nrf2抗体 | Affinity Biosciences | DF7519 | |
| 细胞实验 | AAV8-ApoE/hAATp-EGFP-FT2A-NM_134084-3Flag-SV40 PolyA | GeneChem | -- |
| AAV8-hAAT-shPpia-EGFP | GeneChem | -- | |
| AAV8-hAAT-shPpib-EGFP | GeneChem | -- | |
| 药物处理 | RN-0001 | Farsight Medical Technology | -- |
| Debio-025 | MedChemExpress | HY-12559 | |
| CRV431 | MedChemExpress | HY-135644 | |
| 细胞毒性检测 | 细胞毒性LDH检测试剂盒 | MedChemExpress | HY-K1090 |
| 凋亡检测 | 凋亡检测试剂盒 | Vazyme | A211-01 |
| 钙调磷酸酶活性检测 | 钙调磷酸酶活性检测试剂盒 | Enzo Life Sciences | BML-AK804-0001 |
| 钙离子检测 | 钙离子比色检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | S1063S |
| 线粒体分离 | 线粒体分离试剂盒 | MedChemExpress | HY-K1061 |
| ATP/ADP比率检测 | ATP/ADP比率检测试剂盒 | Abcam | ab65313 |
| 甘油三酯检测 | 甘油三酯含量检测试剂盒 | Solarbio | BC0625 |
| 游离脂肪酸检测 | 非酯化游离脂肪酸检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K013 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| DMEM/F12培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 转铁蛋白 | -- | -- | |
| 硒 | -- | -- | |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| 逆转录PCR | PrimeScript RT Master Mix | Takara | -- |
| qPCR | SYBR Green qPCR Master Mix | -- | -- |
| 细胞脂质染色 | 尼罗红 | -- | -- |
| 细胞核染色 | DAPI | -- | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC | -- | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 生化检测 | Chemray 800生化分析仪 | Rayto Life and Analytical Sciences | -- |
| ELISA | ELISA试剂盒 | -- | -- |
| 组织学 | 油红O | -- | -- |
| 免疫荧光 | ProLong Gold封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX Red | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解和提取缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白浓度检测试剂盒 | -- | -- |
| Western blot | ECL化学发光底物 | -- | -- |
| RNA-seq | 安捷伦Bioanalyzer 2100 | Agilent | -- |
| RNA Nano 6000试剂盒 | Agilent | -- | |
| NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒（Illumina） | New England Biolabs | #E7530L | |
| 透射电镜 | Leica EM UC7超薄切片机 | Leica | -- |
| 日立HT7700透射电镜 | Hitachi | -- | |
| 分子对接 | 蛋白质数据库 | -- | -- |
| MST | Monolith NT.115 Blue/Green | NanoTemper | -- |
| SPR | Biacore T200 | GE Healthcare | -- |
| NTA芯片 | GE Healthcare | #BR100407 | |
| 线粒体呼吸功能测定 | XF24分析仪 | Seahorse Bioscience | -- |
| Clark型氧电极 | Hansatech | -- | |
| 荧光检测 | Synergy Neo 2酶标仪 | Bio-Tek | -- |
| 药代动力学 | Kinetica 5.0药代动力学分析软件 | -- | -- |
| 动物实验 | C57BL/6J小鼠 | GemPharmatech | N000295 |
| 细胞实验 | AML12细胞系 | ATCC | CRL-2254 |
| RAW264.7细胞系 | ATCC | TIB-71 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ALD小鼠模型建立（NIAAA模型） | 小鼠品系、年龄、性别；乙醇饮食浓度（5% v/v）和喂养时长（10天）；第16天乙醇灌胃剂量（5 g/kg）及灌胃后处死时间（9小时）；对照组等热量饮食。 阅读提示：Methods: NIAAA model of alcohol-associated liver disease and drug administration |
| RN-0001给药 | 给药剂量（10 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、给药频率（每日一次）、给药周期（与NIAAA模型同步）。 阅读提示：Methods: NIAAA model of alcohol-associated liver disease and drug administration |
| 肝细胞特异性CypD敲除小鼠（CypDΔHep） | 小鼠基因型（Alb-Cre+ PpifF/F）及构建方法（CRISPR/Cas9靶向Ppif外显子4-5）；对照小鼠（Alb-Cre- PpifF/F）；小鼠周龄（7周）和性别（雄性）。 阅读提示：Methods: Generation of hepatocyte-specific CypD-deficient mice (CypDΔHep) |
| 体外乙醇诱导肝细胞损伤模型 | RAW264.7细胞预处理条件（RN-0001、Debio-025或CRV431浓度、LPS 10 ng/mL刺激6小时）；AML12细胞处理（RAW264.7条件培养基+50 mM乙醇）；细胞处理时间。 阅读提示：Methods: Ethanol-induced hepatocyte injury model |
| 线粒体功能检测 | 线粒体分离方法（匀浆、Percoll梯度离心）；线粒体肿胀测定条件（Ca2+浓度1 μmol/mg蛋白，时间12分钟）；钙保留能力测定（Fluo-4 AM探针，CaCl2脉冲40 μM）；线粒体呼吸测定（底物、ADP、FCCP、寡霉素等浓度）。 阅读提示：Methods: Mitochondria isolation, Mitochondrial swelling assay, Measurement of mitochondrial bioenergetic function, Mitochondrial Ca2+ uptake/calcium retention capacity (CRC) |
| RN-0001与CypD结合分析 | MST和SPR实验中的蛋白浓度、RN-0001浓度范围、缓冲液条件；SPR芯片类型（NTA芯片）。 阅读提示：Methods: MST and SPR binding assays |
| I期临床试验 | 受试者年龄（18-45岁）、BMI（18.5-29.9 kg/m2）；给药剂量方案（单次和多次）；安全性和药代动力学评估方法。 阅读提示：Methods: First-in-human phase I clinical trial |