临床样本分析
分析c-Myc扩增和表达与ESCC患者临床特征（转移、化疗耐药、预后）的关系。
对663对ESCC肿瘤及配对正常组织进行全基因组测序，分析c-Myc扩增率、表达差异，并关联临床信息。
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靶向c-Myc-p300-CARM1复合物诱导食管鳞状细胞癌铁死亡并减少CD8+ T细胞耗竭
Targeting c-Myc-p300-CARM1 complex induces ferroptosis and reduces CD8+ T cell exhaustion in esophageal squamous cell carcinoma.
实验完整度
高研究包含体外细胞实验（药物筛选、增殖、Co-IP、ChIP、代谢检测）、类器官模型、动物移植瘤模型及患者样本分析，并进行了功能验证（铁死亡）和机制验证（转录复合物及下游代谢通路）。
主要模型
ESCC细胞系KYSE450、KYSE510、KYSE30、KYSE150、AKR 患者来源类器官（PDO） AKR细胞皮下移植瘤模型（C57BL/6J小鼠） 4NQO诱导的ESCC小鼠模型 663例ESCC患者肿瘤及配对正常组织队列
重点核对
SGC2085浓度25 μM，MYCi975浓度10 μM，处理时间48小时（体外实验） 动物实验中SGC2085给药剂量100 mg/kg口服，MYCi975 100 mg/kg腹腔注射，连续14天 AKR细胞接种数量3×10^5细胞/只，C57BL/6J小鼠 铁死亡检测使用BODIPY-C11染色，ELISA检测花生四烯酸水平 ChIP-qPCR验证c-Myc与CAD和DHODH启动子结合
摘要
c-Myc基因的扩增和高表达促进癌症的增殖和转移，导致治疗耐药和不良预后。在本研究中，我们分析了663对食管鳞状细胞癌（ESCC）肿瘤及匹配的邻近非癌食管组织的全基因组测序数据。分析显示，c-Myc的扩增率为16.4%，其高表达与肿瘤转移、化疗耐药和患者不良预后显著相关。目前抑制c-Myc致癌功能的药物效果有限。因此，我们筛选了能够增敏c-Myc抑制剂的药物。我们发现，CARM1抑制剂SGC2085增强了c-Myc抑制剂MYCi975的疗效。这种组合通过c-Myc中的R371和R372以及CARM1中的E75和Y153破坏转录c-Myc-p300-CARM1（CPC）复合物。此外，该组合促进花生四烯酸的积累，进而诱导铁死亡。此外，SGC2085和MYCi975的组合显著增加了B细胞、CD8+ T细胞浸润，并降低了CD8+ T细胞耗竭水平、中性粒细胞和MDSC。这些发现表明，SGC2085和MYCi975可以破坏转录复合物CPC，影响代谢途径，并重编程免疫微环境。这项研究为ESCC患者提供了一种潜在的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- c-Myc在食管鳞状细胞癌中的致癌机制及靶向c-Myc的药物联合治疗策略。
- 核心机制
- SGC2085和MYCi975通过破坏c-Myc-p300-CARM1转录复合物，抑制下游嘧啶从头合成（下调CAD、DHODH、UMPS），并上调花生四烯酸水平，诱导铁死亡，同时重编程肿瘤免疫微环境，减少CD8+ T细胞耗竭。
- 主要证据
- 基于663例ESCC患者样本的全基因组测序和临床关联分析，体外细胞实验、类器官模型和动物移植瘤模型显示联合用药显著抑制增殖并诱导铁死亡；Co-IP和ChIP实验验证复合物破坏及c-Myc对代谢酶的直接结合。
- 研究意义
- 为ESCC患者提供了一种潜在的联合治疗策略，可能改善化疗耐药患者的预后。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
药物筛选
筛选能选择性抑制c-Myc缺失细胞生长的药物，以增敏c-Myc抑制剂。
利用CRISPR-Cas9敲除KYSE450细胞中的c-Myc，筛选768种小分子抑制剂（20 μM，24小时），进一步用siRNA验证，并评估SGC2085在低c-Myc表达细胞中的效果。
联合用药体外验证
验证SGC2085和MYCi975联合用药对ESCC细胞增殖的抑制作用。
在5种ESCC细胞系中进行药物敏感性测试和联合用药实验，使用Incucyte活细胞成像、Livecyte细胞运动分析、平板克隆形成、CCK-8及Bliss协同评分。
类器官实验
在患者来源类器官模型中验证联合用药的抗肿瘤效果。
将4NQO诱导小鼠的组织建立类器官，分别或联合用SGC2085（25 μM）和MYCi975（10 μM）处理，观察类器官形态变化。
体内动物实验
评估联合用药在皮下移植瘤模型中的疗效和毒性。
将AKR细胞皮下接种至C57BL/6J小鼠，分组后给予SGC2085、MYCi975或联合治疗，测量肿瘤体积、重量和小鼠生存期，并检测主要器官毒性。
复合物形成验证
验证c-Myc、CARM1和p300之间的直接相互作用。
通过外源性Co-IP（HEK293T细胞共转染）和内源性Co-IP（KYSE450细胞），结合分子对接和突变分析，确定关键结合位点。
转录复合物破坏验证
验证药物联合能否破坏c-Myc-p300-CARM1复合物。
在药物处理后通过Co-IP检测复合物成分的相互作用变化，比较单独和联合用药的效果。
代谢组学和转录组学分析
探究联合用药对代谢通路和基因表达的影响。
进行RNA-seq和KEGG通路富集分析，以及非靶向代谢组学检测，鉴定差异代谢物和通路。
花生四烯酸和嘧啶合成检测
验证联合用药对花生四烯酸水平和嘧啶从头合成的影响。
通过ELISA检测花生四烯酸浓度，通过RT-qPCR检测CAD、DHODH、UMPS的表达，并考察代谢酶PLA2、PLAA、5-LOX等。
铁死亡验证
验证联合用药诱导ESCC细胞铁死亡。
使用BODIPY-C11染色和流式细胞术检测脂质ROS水平，通过Western blot和RT-qPCR检测铁死亡标志物（GPX4, FTH1, ACSL4, COX2）表达。
机制验证（ChIP）
验证c-Myc直接结合代谢酶基因的启动子区域，并检测药物对结合的影响。
使用ChIP和ChIP-qPCR检测c-Myc与CAD、DHODH等基因启动子的结合，比较药物处理前后的富集变化。
免疫微环境分析
评估联合用药对肿瘤免疫微环境的影响。
通过流式细胞术和多重免疫荧光检测肿瘤组织中免疫细胞亚群（CD8+ T、CD4+ T、B细胞、中性粒细胞、MDSC等）的比例和CD8+ T细胞耗竭状态。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | SGC2085 | MCE | HY-100565 |
| MYCi975 | Selleck | S8906 | |
| EZM2302 | MCE | HY-111109 | |
| Erastin | MCE | HY-15763 | |
| shRNA敲降 | pSIH-H1-puro载体 | -- | -- |
| 慢病毒包装 | pMD2.G包装质粒 | Addgene | #12259 |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | #12260 | |
| 转染 | 脂质体转染试剂 | Yeasen | 40802 |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 类器官培养 | 胶原酶/透明质酸酶 | STEMCELL Technologies | #07912 |
| 改良Hank's平衡盐溶液 | STEMCELL Technologies | #37150 | |
| Western blot | β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 |
| c-Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 9402 | |
| CARM1抗体 | Abcam | ab243638 | |
| P300抗体 | Cell Signaling Technology | 54062 | |
| Flag标签抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| Myc标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2272 | |
| HA标签抗体 | Abcam | ab236632 | |
| GPX4抗体 | Cell Signaling Technology | 52455 | |
| ACSL4抗体 | Abcam | ab155282 | |
| FTH1抗体 | Abcam | ab75973 | |
| COX2抗体 | Abcam | ab179800 | |
| 裂解缓冲液 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 0 469 315 9001 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | 0 490 684 5001 | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| 免疫沉淀 | anti-HA磁珠 | MCE | HY-K0201 |
| anti-c-Myc磁珠 | MCE | HY-K0206 | |
| anti-Flag磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 | |
| protein A/G磁珠 | MCE | HY-K0202 | |
| Western blot | PVDF膜 | Merck Millipore | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Scientific | -- |
| 逆转录 | Quantscript逆转录试剂盒 | Tiangen | KR103 |
| qPCR | PowerUp SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | A25742 |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | TargetMol | KA288282 |
| 活细胞成像 | Incucyte S3显微镜 | Essen Bioscience | -- |
| Livecyte 419相位聚焦显微镜 | Essen Bioscience | -- | |
| ELISA | 花生四烯酸ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology | E-EL-0051c |
| 铁死亡检测 | BODIPY 581/591 C11荧光探针 | -- | -- |
| ChIP | SimpleChIP酶法染色质IP试剂盒 | Cell Signaling Technology | #9003 |
| ChIP-qPCR | SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | #4309155 |
| 多重免疫荧光 | 七色多标记试剂盒 | PANOVUE | TSA-Rab-247259 |
| CD8抗体 | Abcam | ab217344 | |
| CD4抗体 | Abcam | ab288724 | |
| Epcam抗体 | Abcam | ab71916 | |
| CD19抗体 | Cell Signaling Technology | 90176 | |
| PD1抗体 | Cell Signaling Technology | 84651 | |
| Tim3抗体 | Abcam | ab241322 | |
| panCK抗体 | Abcam | ab7753 | |
| c-Myc抗体 | Abcam | ab32072 | |
| CARM1抗体 | Abcam | ab243638 | |
| p300抗体 | Abcam | ab275379 | |
| Vectra Polaris自动定量病理成像系统 | PerkinElmer | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 药物筛选 | 细胞系c-Myc-WT和c-Myc-KO KYSE450细胞，药物浓度20 μM，处理时间24小时，筛选阈值（c-Myc-KO/c-Myc-WT活力比<0.65或>1.5） 阅读提示：Materials and Methods：Drug library screen |
| 细胞培养 | ESCC细胞系在RPMI-1640培养基，HEK293T在DMEM培养基，均含10% FBS，37°C和5% CO2 阅读提示：Materials and Methods：Cell culture |
| 联合用药体外实验 | 药物浓度：SGC2085 25 μM，MYCi975 10 μM；处理时间：48小时（Bliss分析）或72小时（Incucyte）；细胞系：KYSE30, KYSE150, KYSE450, KYSE510, AKR 阅读提示：Materials and Methods：Half maximal inhibitory concentration (IC50) and Bliss index analysis；Live-cell microscopy |
| 类器官实验 | 类器官培养条件：细胞密度16,000 cells/well，药物浓度SGC2085 25 μM，MYCi975 10 μM，隔天添加 阅读提示：Materials and Methods：Organoid culture and drug treatments |
| 动物实验 | AKR细胞3×10^5 cells皮下移植，C57BL/6J小鼠（6周龄，雄性），给药方案：SGC2085 100 mg/kg口服，MYCi975 100 mg/kg腹腔注射，持续14天；联合组剂量均为50 mg/kg 阅读提示：Materials and Methods：Animal experiments |
| 花生四烯酸检测 | ELISA试剂盒：Elabscience Biotechnology, E-EL-0051c；样本处理：细胞裂解物或组织提取物 阅读提示：Materials and Methods：ELISA for determining arachidonic acid concentration |
| 铁死亡检测 | BODIPY 581/591 C11染色浓度3 mM，孵育30分钟（37°C），流式细胞术测定脂质ROS 阅读提示：Materials and Methods：BODIPY-C11 staining |
| ChIP实验 | SimpleChIP试剂盒（CST #9003），c-Myc抗体（CST #9402），细胞KYSE450 阅读提示：Materials and Methods：ChIP qPCR |
| 免疫微环境分析 | 流式抗体列表见补充表S3；多重免疫荧光使用PANOVUE试剂盒，抗体清单（CD8, CD4, Epcam, CD19等） 阅读提示：Materials and Methods：Flow cytometry；Multiplex immunofluorescence assay |
| 数据分析 | 统计检验：非配对t检验；协同分析：SynergyFinder Bliss模型；显著性阈值：P<0.05 阅读提示：Materials and Methods：Statistical analysis；Bliss index analysis |