纳米颗粒的制备与表征
合成C3G-Cs-SeNPs并表征其物理化学性质
通过自组装方法合成C3G-Cs-SeNPs，使用SEM、TEM、XPS、XRD、UV-Vis和DLS表征其形貌、尺寸、电位、元素组成和稳定性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
自组装矢车菊素-3-O-葡萄糖苷纳米颗粒减轻PRRSV感染诱导的炎症和铁死亡
Self-assembled cyanidin-3-O-glucoside nanoparticles alleviate inflammation and ferroptosis induced by PRRSV infection.
实验完整度
高包括纳米颗粒表征、体外抗氧化、抗病毒活性、炎症和铁死亡标志物检测，以及siRNA敲低和抑制剂验证，功能验证和机制验证完整。
主要模型
Marc-145细胞 rPAMs细胞 PRRSV BB0907株、S1株和FJ1402株
重点核对
C3G-Cs-SeNPs浓度梯度（7.5、15、30 μg/mL） PRRSV感染MOI为0.1 siRNA介导的SIRT1敲低 Nrf2抑制剂ML385处理 检测TCID50、RT-qPCR、Western blot和IFA
摘要
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种高度传染性病原体，主要通过损害繁殖性能和呼吸系统健康，给全球养猪业造成巨大的经济损失。然而，目前有效控制PRRSV感染的治疗方法仍然有限。本文中，我们提出了自组装的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）纳米颗粒（C3G-Cs-SeNPs）作为一种有前景的抗PRRSV感染的抗病毒剂。这些纳米颗粒表现出优异的稳定性和生物相容性，在Marc-145细胞中具有极低的细胞毒性。C3G-Cs-SeNPs显著降低了PRRSV感染细胞中的ROS水平，增强了抗氧化能力并减轻了氧化应激。此外，它们有效抑制了PRRSV生命周期的关键阶段，包括病毒内化和复制，导致病毒增殖显著减少。此外，C3G-Cs-SeNPs通过增强抗氧化酶活性恢复氧化还原稳态，从而减轻铁死亡。机制上，这些纳米颗粒可能激活SIRT1/Nrf2/HO-1信号通路，该通路在调节PRRSV感染细胞的炎症和铁死亡中发挥关键作用。这些发现表明，C3G-Cs-SeNPs可以作为调节呼吸道病毒感染中炎症、铁死亡和病毒复制的新型治疗方法。我们的研究强调了C3G-Cs-SeNPs对抗PRRSV感染的治疗潜力，对病毒感染管理和呼吸道疾病治疗具有重要意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- C3G-Cs-SeNPs是否能减轻PRRSV感染诱导的炎症和铁死亡，其机制是否涉及SIRT1/Nrf2/HO-1通路？
- 核心机制
- C3G-Cs-SeNPs通过激活SIRT1/Nrf2/HO-1信号通路，增强抗氧化酶活性，恢复氧化还原稳态，从而抑制炎症和铁死亡，并抑制PRRSV内化和复制。
- 主要证据
- 在Marc-145细胞和rPAMs中，C3G-Cs-SeNPs剂量依赖性降低促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和铁死亡标志物（COX2、Keap1）表达，升高GPX4、SLC7A11、FTH1等，并降低ROS和脂质过氧化；SIRT1敲低或Nrf2抑制逆转保护作用。
- 研究意义
- C3G-Cs-SeNPs作为一种宿主导向的抗病毒候选药物，为治疗PRRSV及其他呼吸道病毒感染提供新策略，并有助于理解铁死亡在PRRSV发病机制中的作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外抗氧化活性测定
评估C3G-Cs-SeNPs清除自由基的能力
测定C3G、Cs-SeNPs和C3G-Cs-SeNPs对ABTS•+、DPPH•、•OH和H2O2的清除能力。
细胞毒性试验
评估C3G-Cs-SeNPs对宿主细胞的毒性
使用CCK-8法检测不同浓度（0-60 μg/mL）的C3G、Cs-SeNPs和C3G-Cs-SeNPs处理Marc-145细胞和rPAMs 24、36、48小时后的细胞活力。
抗病毒活性测定
检测C3G-Cs-SeNPs对PRRSV增殖的抑制效果
PRRSV（MOI=0.1）感染Marc-145细胞1小时，然后加入不同浓度的C3G、Cs-SeNPs和C3G-Cs-SeNPs处理，检测病毒滴度、ORF7 mRNA表达、N蛋白表达和荧光信号。
PRRSV生命周期阶段抑制实验
明确C3G-Cs-SeNPs抑制PRRSV感染的具体阶段
分别设计吸附、内化、复制和释放阶段实验，检测各阶段病毒滴度、ORF7表达和N蛋白水平。
炎症因子表达检测
评估C3G-Cs-SeNPs对PRRSV诱导的炎症反应的影响
PRRSV感染后，C3G-Cs-SeNPs处理，检测IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白和mRNA表达水平。
氧化应激和铁死亡标志物检测
评估C3G-Cs-SeNPs对PRRSV诱导的氧化应激和铁死亡的影响
检测ROS水平、MDA、MPO、SOD、CAT、GSH活性，以及铁死亡相关蛋白（COX2、SLC7A11、Keap1、FTH1、GPX4）的表达和线粒体膜电位。
信号通路机制验证
验证C3G-Cs-SeNPs是否通过SIRT1/Nrf2/HO-1通路发挥作用
检测SIRT1、Nrf2、HO-1、NQO1的表达，并使用siRNA敲低SIRT1、Nrf2抑制剂ML385处理，观察对炎症、铁死亡和抗病毒效果的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 纳米颗粒制备 | 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷 | Aladdin | C137683 |
| 壳聚糖 | Macklin | C6340 | |
| 氧化应激检测 | 超氧化物歧化酶检测试剂盒 | Solarbio | BC5165 |
| 丙二醛检测试剂盒 | Solarbio | BC0025 | |
| 谷胱甘肽检测试剂盒 | Solarbio | BC1175 | |
| 过氧化氢酶检测试剂盒 | Solarbio | BC0205 | |
| 髓过氧化物酶检测试剂盒 | Solarbio | BC5715 | |
| 炎症因子检测 | IL-1β ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0037 |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0044 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M3063 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | GIBCO | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 纳米颗粒表征 | 扫描电子显微镜 | Zeiss | sigma 300 |
| 透射电子显微镜 | JEOL | F200 | |
| X射线光电子能谱仪 | Thermo Fisher Scientific | K-Alpha | |
| X射线衍射仪 | Bruker | D8 Advance | |
| ZetaSizer纳米粒度仪 | Malvern | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI染料 | Invitrogen | -- |
| 荧光显微镜 | Leica | DM4000 B | |
| RNA提取和qPCR | Qiagen RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| qPCR | 反转录定量PCR试剂盒 | TaKaRa | -- |
| SYBR Premix Ex TaqTM II | TaKaRa | -- | |
| Western blot | 抗IL-1β抗体 | Proteintech | 16806-1-AP |
| 抗IL-6抗体 | Proteintech | 21865-1-AP | |
| 抗TNF-α抗体 | Proteintech | 17590-1-AP | |
| 抗COX2抗体 | Proteintech | 27308-1-AP | |
| 抗Keap1抗体 | Proteintech | 10503-2-AP | |
| 抗SLC7A11抗体 | Proteintech | 26864-1-AP | |
| 抗FTH1抗体 | Proteintech | 11682-1-AP | |
| 抗GPX4抗体 | Huaan | ET1706-45 | |
| 抗SIRT1抗体 | Proteintech | 13161-1-AP | |
| 抗Nrf2抗体 | Abmart | T55136 | |
| 抗HO-1抗体 | Proteintech | 10701-1-AP | |
| 抗NQO1抗体 | Abmart | T56710 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abmart | P30008 | |
| 抗PRRSV N蛋白抗体 | GeneTex | GTX637947 | |
| 山羊抗兔IgG二抗 | Abcam | -- | |
| 山羊抗小鼠IgG二抗 | Abcam | -- | |
| 增强化学发光系统 | Beyotime | P0018M | |
| ROS检测 | DCF-DA活性氧检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1染料 | MedChemExpress | HY-K0601 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 纳米颗粒制备 | 壳聚糖浓度、Na2SeO3浓度、C3G浓度、搅拌时间、离心转速 阅读提示：见材料与方法“Preparation of C3G-Cs-SeNPs” |
| 细胞培养 | 细胞系（Marc-145、rPAMs）、培养基（DMEM、RPMI 1640）、FBS浓度、青霉素/链霉素浓度 阅读提示：见材料与方法“Reagents, cells, and virus” |
| 抗病毒实验 | PRRSV MOI、感染时间、处理浓度（0-30 μg/mL）、处理时间（48小时） 阅读提示：见材料与方法“Antiviral activity assay”和结果“C3G-Cs-SeNPs impair PRRSV proliferation in Marc-145 cells” |
| 氧化应激与铁死亡检测 | 感染MOI、处理时间、ROS探针浓度、JC-1浓度 阅读提示：见材料与方法“ROS generation assay”、“Mitochondrial membrane potential assay”和“Intracellular lipid peroxidation assay” |
| 信号通路验证 | siRNA靶序列、siRNA浓度、ML385浓度 阅读提示：见结果“SIRT1 knockdown abolishes the protective effects”和“Nrf2 inhibition reverses the protective effects” |