表型筛选发现PFD的抗EC活性
从33种非三环类精神药物中筛选具有抗EC活性的化合物。
使用CCK-8 assay在ISK细胞中检测40 μM药物处理后的增殖抑制率，发现PFD抑制率最高；随后测定PFD在ISK和KLE细胞中的IC50值，并评估其对迁移、集落形成和凋亡的影响。
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五氟利多通过septin7-Orai/IP3R-Ca2+-PIK3CA通路靶向septin7抑制子宫内膜癌
Penfluridol targets septin7 to suppress endometrial cancer by septin7-Orai/IP3R-Ca2+-PIK3CA pathway.
实验完整度
高包含体外细胞增殖、迁移、凋亡、周期实验，体内异种移植瘤模型，ABPP靶点鉴定，结合热位移、MST、分子对接，以及基因敲低/过表达功能验证和RNA-seq机制研究。
主要模型
ISK人子宫内膜癌细胞系 KLE人子宫内膜癌细胞系 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 septin7敲低KLE细胞异种移植瘤模型
重点核对
PFD在ISK和KLE细胞中的IC50值（48 h：3.48 μM和3.14 μM） ABPP探针BP的IC50值（7.12 μM）及其与PFD的竞争实验 PFD与septin7结合的Kd值（0.98 μM）及突变体结合实验 PFD体内给药剂量（2 mg/kg和5 mg/kg）及给药方式（腹腔注射，连续14天） septin7敲低或过表达对PFD抗增殖效果的影响（4 μM PFD处理）
摘要
细胞生物学；细胞生物学的功能方面；癌症
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 五氟利多（PFD）是否具有抗子宫内膜癌（EC）活性及其分子靶点和作用机制是什么？
- 核心机制
- PFD通过直接结合septin7，抑制Orai/IP3R-Ca2+-PIK3CA-AKT信号通路，诱导细胞凋亡；同时减弱septin7与tubulin的相互作用，抑制微管聚合，导致细胞周期阻滞于G1期。
- 主要证据
- 体外实验显示PFD抑制EC细胞增殖、迁移、集落形成并诱导凋亡；异种移植瘤模型显示PFD抑制肿瘤生长。ABPP、热位移分析、MST和分子对接证实PFD直接结合septin7。septin7敲低减弱PFD的抗肿瘤作用，并影响Orai/IP3R/PIK3CA表达、细胞内Ca2+水平、微管聚合和细胞周期。
- 研究意义
- 研究揭示了septin7作为EC肿瘤抑制因子和潜在治疗靶点，PFD作为靶向septin7的先导化合物，为EC特别是p53突变型EC的治疗提供了新策略，也可能适用于神经母细胞瘤的治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内验证PFD的抗肿瘤效果
评估PFD在异种移植瘤模型中的体内抗肿瘤活性和安全性。
建立KLE细胞皮下异种移植瘤模型，分别给予PFD（2或5 mg/kg）、顺铂（DDP, 2 mg/kg）和溶剂对照，腹腔注射连续14天，监测肿瘤体积、体重、主要脏器HE染色和血液生化指标。
ABPP鉴定PFD的分子靶点
鉴定PFD在EC细胞中的直接分子靶点。
设计并合成含有光交联基团和炔基的PFD活性探针BP，在ISK细胞裂解液中进行ABPP实验，通过竞争实验、pull-down和LC-MS/MS分析，筛选出候选靶蛋白septin7。
验证PFD与septin7的直接结合
确证PFD直接结合septin7并测定结合亲和力。
通过体外重组蛋白标记实验、细胞热位移分析（CETSA）、微量热泳动（MST）和分子对接/分子动力学模拟，验证PFD与septin7直接结合，并鉴定关键结合位点。
转录组学揭示PFD的作用通路
探索PFD抑制EC细胞生长的分子机制。
对PFD处理的EC细胞进行RNA-seq分析，鉴定差异表达基因，进行KEGG通路富集分析，并通过qRT-PCR和Western blot验证关键基因和蛋白的表达变化。
研究PFD对微管聚合和细胞周期的影响
探讨PFD是否通过影响septin7-tubulin相互作用和微管聚合来抑制EC细胞。
通过Co-IP实验检测PFD对septin7与tubulin相互作用的影响；通过免疫荧光观察微管聚合状态；通过流式细胞术分析细胞周期。
证明septin7在EC中的肿瘤抑制功能
明确septin7在EC细胞中的生物学功能。
构建septin7过表达和敲低的ISK和KLE细胞系，检测细胞增殖、集落形成、凋亡相关蛋白表达及Orai/IP3R-Ca2+-PIK3CA-AKT通路的变化。
验证PFD的抗EC活性依赖于septin7
确定septin7是PFD发挥抗EC作用所必需的。
在septin7敲低或过表达的EC细胞中检测PFD的抗增殖、周期阻滞、微管聚合抑制和通路抑制效果；在septin7敲低的异种移植瘤模型中评估PFD的体内抗肿瘤效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Biosharp | -- |
| 胎牛血清 | Bio-Channel | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Yeasen | -- | |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | 107689 | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| 细胞裂解 | RIPA裂解液 | Yeasen | 20114ES60 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Abcam | ab158072 | |
| 细胞培养 | 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Coolabor | SL1086 |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | C1002 |
| 集落形成实验 | 结晶紫染色液 | TargetMol | C0005 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Beyotime | C1021 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Yeasen | 20201ES76 |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A211 |
| 细胞周期检测 | 细胞周期与凋亡分析试剂盒 | Beyotime | C1052 |
| RNA提取 | 总RNA提取试剂盒II | Omega | R6934-01 |
| 逆转录 | Hifair II第一链cDNA合成SuperMix | Yeasen | 11123ES60 |
| qPCR | Hieff qPCR SYBR Green预混液 | Yeasen | 11201ES08 |
| 靶点鉴定 (Pull-down) | Capturem链霉亲和素小柱试剂盒 | Takara | 635733 |
| 靶点鉴定 (Silver staining) | 快速银染试剂盒 | Beyotime | P0017S |
| 钙离子检测 | Fluo-4 AM钙离子荧光探针 | Beyotime | S1060 |
| Western blot | septin7抗体 | Abcam | ab17522 |
| PIK3CA抗体 | Cell Signaling Technology | 4249S | |
| Orai抗体 | ABclonal | A7412 | |
| IP3R抗体 | Abways | Q14643 | |
| AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691S | |
| Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 14420T | |
| cleaved-caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| Tubulin抗体 | Proteintech | 66301-1-Ig | |
| β-actin抗体 | Yeasen | 30103ES | |
| HRP标记抗兔IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| HRP标记抗小鼠IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠IgG (H+L)高交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | A32727 |
| 免疫共沉淀 | FLAG标签抗体（磁珠偶联） | Cell Signaling Technology | 82103S |
| Myc标签抗体（磁珠偶联） | Cell Signaling Technology | 91856S | |
| 对照IgG（磁珠偶联） | Cell Signaling Technology | 8726S | |
| 重组蛋白 | septin7重组蛋白 | Abcam | ab158072 |
| 细胞转染 | 聚乙烯亚胺转染试剂 | Proteintech | PR40001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | ISK和KLE细胞系的来源（ATCC编号：HTB-113, CRL-1622），培养条件（DMEM/F12，10% FBS，1%青霉素-链霉素，37°C，5% CO2） 阅读提示：STAR★Methods - Cell culture |
| 细胞增殖检测 | 细胞接种密度（约5000细胞/孔），药物处理时间（48 h），CCK-8孵育时间（1-2 h），IC50计算方法 阅读提示：STAR★Methods - Cell proliferation assay |
| 体内药效评价 | 动物模型（BALB/c裸鼠），接种细胞系（KLE），接种数量（5×10^7），给药方式（腹腔注射），给药剂量（PFD: 2, 5 mg/kg; DDP: 2 mg/kg），给药时长（14天），肿瘤体积计算方法，样本量（n=5） 阅读提示：STAR★Methods - Mouse tumor xenograft studies, Figure 1 |
| ABPP靶点鉴定 | 探针BP浓度，光交联条件，点击化学试剂比例（探针:TAMRA-N3:TBTA:TCEP:CuSO4 = 1:2:5:50:50），反应时间（2 h），pull-down试剂盒（Capturem Streptavidin Miniprep Columns Kit），LC-MS/MS分析 阅读提示：STAR★Methods - In-gel fluorescence analysis, Pull down/LC-MS/MS |
| 蛋白质结合验证 | 热位移分析的温度梯度（40°C至70°C，12个温度点），PFD浓度（7 μM），MST测定中重组蛋白浓度（50 nM），His-tag标记试剂盒，Kd值计算 阅读提示：STAR★Methods - Thermal shift assay, Microscale thermophoresis assay |
| RNA-seq分析 | PFD处理浓度（5 μM），处理时间（48 h），DEGs筛选标准（adjusted p < 0.05），KEGG富集显著阈值（adjusted p < 0.01） 阅读提示：STAR★Methods - Transcriptome analysis by RNA-seq, Figure 3 |
| 微管聚合检测 | PFD处理浓度梯度，处理时间（24 h），阳性对照（paclitaxel, colchicine），免疫荧光染色方法 阅读提示：STAR★Methods - Immunofluorescence, Figure 4 |
| septin7功能验证 | 慢病毒敲低或过表达构建方法，MOI值，筛选抗生素（puromycin 0.5 μg/mL或blasticidin 30 μg/mL），shRNA序列，验证细胞增殖的PFD浓度（4 μM） 阅读提示：STAR★Methods - Cell transfection, Figures 5 and 6 |