检测IRAIN在CML患者和细胞系中的表达
评估IRAIN在CML中的表达水平及其与伊马替尼耐药的关系
使用qRT-PCR检测健康志愿者、CML和AML患者的骨髓单个核细胞中IRAIN表达；检测CD34+和CD34-细胞、伊马替尼敏感和耐药细胞系（K562和K562/G01）中IRAIN表达；并通过siRNA敲低BCR-ABL1验证对IRAIN表达的影响。
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长链非编码RNA IRAIN通过抑制NF-κB/CD44通路克服慢性髓性白血病的伊马替尼耐药
LncRNA IRAIN overcomes imatinib resistance in chronic myeloid leukemia via NF-κB/CD44 pathway inhibition.
实验完整度
高包含细胞系体外实验、患者样本检测、CD34+原代细胞离体实验，以及RNA pull-down和RIP等机制验证。
主要模型
K562细胞系 K562/G01伊马替尼耐药细胞系 MEG-01细胞系 CML患者骨髓单个核细胞及CD34+细胞
重点核对
IRAIN表达水平与伊马替尼耐药的相关性 IRAIN敲低和过表达对伊马替尼敏感性的影响 IRAIN对CD44表达的调控作用 IRAIN与NF-κB p65的结合机制
摘要
酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的开发革命性地提高了慢性髓性白血病（CML）患者的总生存率。然而，耐药性仍然是主要障碍。在此，我们证明了一种BCR-ABL1非依赖的长链非编码RNA IRAIN在CML中组成性低表达，导致伊马替尼耐药。IRAIN敲低降低了CD34+ CML原始细胞和细胞系对伊马替尼的敏感性，而IRAIN过表达显著增加了敏感性。机制上，IRAIN通过结合核因子κB亚基p65来下调CD44（一种有利于TKI耐药的膜受体），从而降低p65和磷酸化p65的表达。因此，去甲基化药物地西他滨（可上调IRAIN）与伊马替尼联合使用，形成了一种可用于对TKI耐药的CML的双重治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BCR-ABL1非依赖的lncRNA IRAIN在CML中低表达是否导致伊马替尼耐药及其机制。
- 核心机制
- IRAIN通过结合NF-κB p65，降低p65和磷酸化p65水平，从而下调CD44表达，克服伊马替尼耐药。
- 主要证据
- 在CML细胞系（K562、MEG-01）和患者样本中，IRAIN低表达与耐药相关；IRAIN过表达增加伊马替尼敏感性并下调CD44；RNA pull-down和RIP证实IRAIN结合p65。
- 研究意义
- IRAIN可作为CML治疗的潜在靶点，地西他滨联合伊马替尼形成双重治疗策略，克服TKI耐药。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
敲低IRAIN对伊马替尼耐药的影响
验证IRAIN低表达是否导致伊马替尼耐药
在K562和MEG-01细胞中通过siRNA敲低IRAIN，检测细胞增殖（CCK8）和凋亡（流式）对伊马替尼的响应。
过表达IRAIN对伊马替尼耐药的影响
验证IRAIN过表达是否克服伊马替尼耐药
在K562/G01和MEG-01细胞中通过慢病毒过表达IRAIN，检测细胞增殖、凋亡、IC50和克隆形成能力。
验证IRAIN通过CD44调控伊马替尼耐药
确定IRAIN对CD44的调控作用及其在耐药中的功能
RNA-seq分析IRAIN过表达K562细胞中差异基因，发现CD44下调；在CML细胞系和患者样本中检测CD44表达；通过siRNA敲低CD44检测对细胞增殖和凋亡的影响。
机制研究：IRAIN与NF-κB p65的相互作用
阐明IRAIN调控CD44的分子机制
使用RNA pull-down和RNA免疫沉淀（RIP）验证IRAIN与p65的结合；检测p65和磷酸化p65蛋白水平；使用NF-κB抑制剂Bay11-7082或siRNA敲低p65验证其对CD44的影响。
在CD34+ CML原始细胞中验证IRAIN作用
在患者来源细胞中确认IRAIN对伊马替尼敏感性的影响
从CML患者骨髓分离CD34+细胞，通过siRNA敲低或慢病毒过表达IRAIN，检测伊马替尼诱导的凋亡和细胞活力。
地西他滨联合伊马替尼的协同效应
探索地西他滨上调IRAIN并增强伊马替尼敏感性
检测地西他滨处理后IRAIN表达变化；在CML细胞系中联合用药检测凋亡和增殖；并在患者样本中验证地西他滨对IRAIN的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Iscove改良Dulbecco培养基 | Biological Industries | 01-058-1A |
| RPMI-1640培养基 | VivaCell Biosciences | -- | |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | VivaCell Biosciences | -- | |
| 细胞分选 | EasySep人CD34阳性分选试剂盒II | STEMCELL Technologies | 17856 |
| 药物处理 | 甲磺酸伊马替尼 | Sigma Aldrich | 220127-57-1 |
| 地西他滨 | Sigma Aldrich | A3656-5mg | |
| BAY11-7082 | APExBIO | A4210 | |
| 细胞培养 | BIT 9500血清替代物 | STEMCELL Technologies | 09500 |
| 人重组IL-3 | STEMCELL Technologies | 78040 | |
| 人重组IL-6 | STEMCELL Technologies | 78050 | |
| 人重组G-CSF | STEMCELL Technologies | 78012 | |
| 认证胎牛血清 | Biological Industries | 04-001-1ACS | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 |
| Opti-MEM I无血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | APE×BIO | K1018 |
| 凋亡检测 | Annexin V-APC/PI凋亡检测试剂盒 | KeyGEN BioTECH | KGA1030-50 |
| Annexin V-AbFluor 488/PI凋亡检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A211 | |
| 流式分析 | CD34 FITC抗体 | BD Biosciences | 555821 |
| CD44 PE-Cy7抗体 | BD Biosciences | 560533 | |
| Western blot | CD44兔单克隆抗体 | Abcam | ab157107 |
| NF-κB p65兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| 磷酸化NF-κB p65兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3033S | |
| GAPDH兔多克隆抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Accurate Biology | AG21101 |
| 逆转录PCR | Evo M-MLV逆转录试剂盒（含gDNA去除） | Accurate Biology | AG11705 |
| qRT-PCR | SYBR Green Pro Taq HS预混qPCR试剂盒 | Accurate Biology | AG11701 |
| RNA pull-down | Dynabeads MyOne链霉亲和素C1 | Thermo Fisher Scientific | 35002D |
| AmpliScribe T7-Flash转录试剂盒 | Epicentre | ASF3507 | |
| 卵清白蛋白亲和素 | Sigma Aldrich | 189725; | |
| 来自面包酵母的核糖核酸 | Sigma Aldrich | R6750; | |
| RIP | 蛋白A/G磁珠 | Bimake | B23202 |
| RNA酶抑制剂 | Promega | N2115 | |
| 质粒构建 | In-Fusion HD克隆试剂盒 | TakaRa | 639650 |
| T4 DNA连接酶 | Promega | M1801 | |
| Western blot | RIPA裂解液（强） | Beyotime Biotechnology | P0013B |
| 磷酸酶抑制剂混合物II | MedChemExpress | HY-K0022 | |
| 抗小鼠IgG HRP链接单抗 | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| HRP山羊抗兔IgG | Abclonal | AS014 | |
| Tanon ECL化学发光底物 | Tanon | 180-5001 | |
| 克隆形成 | MethoCult H4100甲基纤维素培养基 | STEMCELL Technologies | 04100 |
| RNA测序 | NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒（Illumina） | NEB | E7530L |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 培养基类型、血清浓度、细胞密度、培养条件 阅读提示：STAR Methods - Cell culture |
| RNA干扰 | siRNA序列、浓度、转染试剂、转染时间 阅读提示：STAR Methods - Knockdown of IRAIN with small interfering RNAs |
| 细胞增殖检测 | 细胞接种密度、CCK8孵育时间、检测波长 阅读提示：STAR Methods - Cell proliferation and viability |
| 凋亡检测 | 凋亡试剂盒、染色时间、流式分析 阅读提示：STAR Methods - Apoptosis detection |
| Western blot | 抗体稀释比例、封闭条件、曝光时间 阅读提示：STAR Methods - Western blotting |
| RNA pull-down | 细胞裂解液成分、RNA与磁珠结合条件 阅读提示：STAR Methods - RNA pull-down assay |
| RIP | 抗体、磁珠、交联条件 阅读提示：STAR Methods - RNA immunoprecipitation (RIP) assay |
| 患者样本 | 患者纳入标准、样本类型、处理条件 阅读提示：Experimental model and study participant details |