葛根素通过调节巨噬细胞缓解实验性自身免疫性甲状腺炎

Puerarin Alleviates Experimental Autoimmune Thyroiditis by Regulating Macrophages.

作者信息Qing Tao, Yu Chen, Qiao Liang, Jianfeng Shi, Zhiguo Wang, Haiyan Min, Qian Gao, Xiaoming Yao, Lei Wang
PMID38668725
期刊J Immunol
发布时间2024-06-01
DOI10.4049/jimmunol.2300779

实验完整度

结合了生物信息学分析、临床样本、小鼠模型、细胞实验和巨噬细胞清除实验等多个证据层,并进行功能验证和机制研究。

主要模型

桥本甲状腺炎患者甲状腺组织 实验性自身免疫性甲状腺炎小鼠模型 RAW264.7小鼠巨噬细胞 人巨噬细胞

重点核对

HT患者甲状腺组织中CD68+CD14+巨噬细胞增加 EAT小鼠模型中甲状腺组织炎症细胞浸润评分 IFN-γ刺激RAW264.7细胞诱导M1极化 通过氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞验证葛根素的依赖性

摘要

桥本甲状腺炎(HT)是最常见的器官特异性自身免疫性疾病,主要影响女性。尽管HT的发病机制尚不完全清楚,但一些研究发现巨噬细胞极化在其中发挥作用。葛根素是一种大豆异黄酮化合物,具有抗炎和免疫调节作用,并能调节巨噬细胞的免疫活性。本研究旨在验证葛根素对HT的治疗效果,并探讨其对HT中巨噬细胞极化失衡的调节作用。通过生物信息学分析和分子生物学方法,发现HT患者和模型小鼠中巨噬细胞显著增加。免疫学染色显示,葛根素干预可减少组织炎性细胞浸润。分子生物学检测显示,葛根素可抑制局部和全身炎症水平,以及甲状腺球蛋白和甲状腺过氧化物酶抗体的表达。体内实验结果表明,葛根素可能通过抑制细胞焦亡信号通路来调节巨噬细胞极性并减少炎症损伤。体内巨噬细胞清除实验证明,葛根素依赖巨噬细胞发挥其治疗HT的作用机制。本研究结果表明,巨噬细胞是HT发生发展的重要介质,葛根素可通过调节巨噬细胞极性和炎症状态提供甲状腺组织保护,这为HT的治疗提供了新思路。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
本研究旨在验证葛根素对桥本甲状腺炎的治疗效果,并探讨其对HT中巨噬细胞极化失衡的调节作用。
核心机制
葛根素通过抑制NF-κB/STAT3信号通路和细胞焦亡信号通路,促进巨噬细胞从M1型向M2型极化,从而减轻甲状腺炎症和组织损伤。
主要证据
体外实验显示葛根素抑制IFN-γ诱导的RAW264.7和人巨噬细胞中M1型标志物表达,增加Arg1和CD206表达;Western blot显示葛根素抑制caspase-1/IL-1β通路和NF-κB/STAT3通路。体内实验显示葛根素减少小鼠甲状腺炎症和自身抗体水平,巨噬细胞清除实验证实其作用依赖于巨噬细胞。
研究意义
本研究证实葛根素在器官特异性自身免疫性疾病中的作用,为HT的治疗提供了新的思路。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

生物信息学分析巨噬细胞在HT中的变化

评估HT患者外周血中巨噬细胞比例和M1型极化状态

分析GEO数据集GSE153434中的RNA测序数据,使用xCell估计巨噬细胞相关评分和基因特征,比较HT患者和健康对照的差异。

2

构建EAT小鼠模型并评估葛根素治疗效果

验证葛根素对HT小鼠模型的治疗作用

C57BL/6雌性小鼠通过皮下注射猪甲状腺球蛋白和完全/不完全弗氏佐剂免疫建立EAT模型,并给予葛根素腹腔注射。通过H&E染色、免疫组化、ELISA等方法评估甲状腺炎症、自身抗体和巨噬细胞浸润。

3

巨噬细胞极化检测

明确葛根素对巨噬细胞极化的影响

通过qPCR、流式细胞术和免疫荧光检测甲状腺组织和淋巴结中M1和M2型巨噬细胞标志物的表达。

4

体外巨噬细胞实验

验证葛根素对IFN-γ诱导的巨噬细胞炎症和极化的直接影响及机制

RAW264.7细胞和人巨噬细胞用IFN-γ刺激,并用葛根素处理,通过CCK-8、ELISA、qPCR和Western blot检测细胞活力、炎症因子分泌、M1/M2标志物和焦亡相关蛋白表达。

5

巨噬细胞清除实验

验证葛根素治疗HT的机制依赖于巨噬细胞

使用氯膦酸盐脂质体清除EAT小鼠体内的巨噬细胞,比较葛根素单独或与氯膦酸盐脂质体联合使用的治疗效果,通过H&E染色和ELISA评估。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

样本或模型特征验证
细胞功能变化验证
免疫效应验证
生物信息学分析

产品清单

实验环节名称品牌货号
抗小鼠F4/80抗体BioLegend123113
抗小鼠诱导型一氧化氮合酶抗体BioLegend696803
抗CD45抗体Cell Signaling Technology70275
抗CD14抗体Abcamab221678
抗CD68抗体Abcamab283654
Alexa Fluor 594Abcamab150116
Alexa Fluor 488Abcamab150113
共聚焦显微镜Olympus--
TG抗体ELISA试剂盒CusabioCSB-E08241m
TPO抗体ELISA试剂盒CusabioCSB-E08353m
IL-10 ELISA试剂盒ElabscienceE-MSEL-M0031
IL-17A ELISA试剂盒ElabscienceE-MSEL-M0006
CCL2 ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-M3001
TNF-α ELISA试剂盒ElabscienceE-MSEL-M0002
IL-6 ELISA试剂盒ElabscienceE-MSEL-M0001
IL-1β ELISA试剂盒ElabscienceE-MSEL-M0003
酶标仪BioTek Instruments--
TRIzol试剂Vazyme Biotech--
PrimeScript RT试剂盒Vazyme Biotech--
SYBR Green 混合液Vazyme Biotech--
ViiA 7实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems--
DMEM培养基Life Technologies--
青霉素/链霉素Life Technologies--
恒温培养箱Thermo Fisher Scientific--
干扰素-γSigma-Aldrich--
细胞计数试剂盒-8Beyotime Technology--
酶标仪Thermo Fisher Scientific--
组织解离试剂盒Miltenyi Biotec--
CD11b磁珠试剂盒Miltenyi Biotec--
RPMI 1640培养基Life Technologies--
巨噬细胞集落刺激因子----
BCA蛋白定量试剂盒Thermo Fisher Scientific--
抗IL-1β抗体Cell Signaling Technology2022
抗cleaved caspase-1抗体Cell Signaling Technology4199
抗caspase-1抗体Cell Signaling Technology2225
抗p65抗体Cell Signaling Technology8242S
抗磷酸化p65抗体Cell Signaling Technology3033S
抗磷酸化STAT3抗体Cell Signaling Technology9145P
抗STAT3抗体Cell Signaling Technology9132
抗GAPDH抗体Bioword Technology110603
HRP标记的山羊抗兔二抗BioworldAB65151
ECL Plus化学发光试剂----
Quality One成像系统Bio-Rad Laboratories--
猪甲状腺球蛋白----
完全弗氏佐剂----
不完全弗氏佐剂----
葛根素注射液Shandong Fangming Pharmaceutical GroupH20033292

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
EAT小鼠模型构建
动物品系、性别、年龄、免疫原剂量(猪甲状腺球蛋白)、佐剂类型、免疫途径、免疫时间、葛根素剂量、给药方式、给药频率
阅读提示:Materials and Methods - Construction of an experimental autoimmune thyroiditis mouse model
体外巨噬细胞实验
细胞系、培养条件、刺激物(IFN-γ)浓度、处理时间、葛根素浓度、细胞密度、分组设置
阅读提示:Materials and Methods - Cell culture, figure 5 legend
人巨噬细胞培养
PBMC来源、分离方法、M-CSF浓度及诱导时间、培养条件、IFN-γ和葛根素处理浓度及时间
阅读提示:Materials and Methods - Extraction and culture of human macrophages
巨噬细胞清除实验
氯膦酸盐脂质体剂量、给药时间、给药途径、对照组设置、模型构建方法
阅读提示:Materials and Methods - Macrophage clearance assay