分离和鉴定患者来源的CAFs和NFs
验证从人前列腺癌组织中分离的CAFs和NFs的纯度和特征。
从30例前列腺癌患者的根治性前列腺切除术标本中分离肿瘤和良性组织，通过酶消化获得原代成纤维细胞，并用流式细胞术、Western blot和免疫荧光检测标志物。
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癌症相关成纤维细胞通过CCL5-CCR5旁分泌轴促进前列腺癌中恩杂鲁胺耐药和PD-L1表达
Cancer-associated fibroblasts promote enzalutamide resistance and PD-L1 expression in prostate cancer through CCL5-CCR5 paracrine axis.
实验完整度
高包含人原代CAFs/NFs分离鉴定、转录组分析、体外细胞功能及机制实验、体内异种移植瘤模型及免疫组化验证等独立证据层级，并有明确功能验证与机制验证。
主要模型
22RV1和C4-2细胞系 人原代CAFs和NFs 22RV1异种移植瘤模型（BALB/c裸鼠）
重点核对
CAFs和NFs的分离来源及配对验证 恩杂鲁胺处理浓度和时间（10 μM，24小时） CCL5重组蛋白浓度（20或40 ng/mL） CCR5拮抗剂MVC和AKT抑制剂MK-2206的处理浓度 动物模型中细胞接种比例（1:1）、给药剂量及分组
摘要
癌症相关成纤维细胞（CAFs）已被证明在前列腺癌治疗耐药中发挥关键作用，但CAFs在前列腺癌恩杂鲁胺治疗初期过程中的作用仍不清楚。我们的研究揭示，CAFs分泌CCL5，促进前列腺癌细胞中雄激素受体（AR）表达上调，导致对恩杂鲁胺治疗的耐药。此外，CCL5还增强肿瘤程序性死亡配体1（PD-L1）的表达，导致免疫逃逸。机制上，CCL5与前列腺癌细胞上的受体CCR5结合，并激活AKT信号通路，导致AR和PD-L1上调。CCR5拮抗剂马拉维罗抑制CAFs介导的CCL5信号通路，可有效降低AR和PD-L1的表达，并提高恩杂鲁胺的疗效。本研究强调了一种靶向CCL5-CCR5信号通路以提高恩杂鲁胺疗效的有前景的治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CAFs是否通过CCL5-CCR5旁分泌轴影响前列腺癌细胞对恩杂鲁胺的敏感性及PD-L1表达？
- 核心机制
- CAFs分泌的CCL5与前列腺癌细胞上的CCR5结合，激活AKT信号通路，上调AR和PD-L1表达，导致恩杂鲁胺耐药和免疫逃逸。
- 主要证据
- 体外实验显示CAF-CM或CCL5可降低恩杂鲁胺诱导的凋亡并增加细胞存活，而siRNA敲低CCL5或CCR5、中和抗体、MVC或MK-2206可逆转这些效应；体内异种移植瘤模型证实MVC联合恩杂鲁胺显著抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 靶向CCL5-CCR5轴可增强恩杂鲁胺疗效，并可能为联合免疫检查点抑制剂治疗晚期前列腺癌提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估CAF-CM对恩杂鲁胺诱导的细胞凋亡和存活的影响
确定CAFs是否通过旁分泌方式保护前列腺癌细胞免受恩杂鲁胺的细胞毒性。
用CAF-CM或对照培养基预处理22RV1和C4-2细胞24小时，随后加入Enz或DMSO处理24小时，通过AnnexinV FITC/PI染色和CCK-8检测凋亡和细胞存活。
转录组分析及CCL5表达验证
鉴定CAFs中差异表达基因并验证CCL5的表达和分泌。
对3组配对NFs和CAFs进行RNA-seq，GSEA分析富集通路，通过RT-qPCR、免疫荧光、ELISA检测CCL5表达和分泌，并在TCGA-PRAD中分析相关性和表达差异。
验证CCL5在恩杂鲁胺耐药中的作用
验证CCL5是否模拟CAF-CM的保护作用，以及敲低或中和CCL5是否减弱该效应。
用重组人CCL5处理22RV1和C4-2细胞，或使用siRNA敲低CAFs中CCL5、或使用中和抗体预处理CAF-CM，然后进行凋亡和存活分析。
验证CCR5在CAF介导的耐药中的作用
确定CCL5-CCR5轴是否介导CAFs对前列腺癌细胞恩杂鲁胺耐药的影响。
使用siRNA敲低22RV1和C4-2细胞中CCR5，或用CCR5拮抗剂MVC预处理，然后加入CAF-CM和Enz，检测凋亡和存活。
探索下游AKT信号通路和AR表达调控
明确CCL5-CCR5信号是否通过AKT通路上调AR表达。
通过Western blot检测AKT磷酸化和AR表达，使用MVC和AKT抑制剂MK-2206进行干预，分析CCL5诱导的AKT激活和AR上调是否被抑制。
体内异种移植瘤模型评估联合治疗
评估MVC联合Enz在体内对CAF促进的肿瘤生长的影响。
将22RV1细胞与CAFs以1:1比例皮下接种BALB/c裸鼠，10天后随机分组，分别给予Enz、MVC、Enz+MVC或对照，监测肿瘤体积和体重。
探究CCL5对PD-L1表达的调控
研究CCL5是否通过CCR5-AKT轴上调肿瘤细胞PD-L1表达。
用CCL5处理22RV1和C4-2细胞，通过RT-qPCR、Western blot和流式细胞术检测PD-L1表达，并用MVC和MK-2206进行干预验证信号通路。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离和培养 | I型胶原酶 | Worthington | LS004194 |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | C11875 |
| DMEM培养基 | Gibco | C11995 | |
| 胎牛血清 | ExCell Bio | FSP500 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140 | |
| 细胞处理 | 二甲基亚砜 | Solarbio | D8371 |
| 动物实验 | 基质胶 | Corning | 354262 |
| 药物处理 | 恩杂鲁胺 | Selleck Chemicals | S1250 |
| 马拉维罗 | Selleck Chemicals | S2003 | |
| MK-2206 AKT抑制剂 | Selleck Chemicals | S1078 | |
| 细胞处理 | 重组人RANTES (CCL5) | PeproTech | AF-300-06 |
| 细胞培养 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | 13778150 |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A211 |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞计数试剂盒 | APExBIO | K1018 |
| ELISA | CCL5 ELISA试剂盒 | J&L Biological | JL11689 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | ThermoFisher | 15596 |
| RNA纯化 | RNA快速纯化试剂盒 | ESscience | RN001 |
| RT-qPCR | ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711 |
| HiScript III一步法RT SuperMix | Vazyme | R333 | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0011 |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物(100x) | Cwbiotech | CW2200S |
| 磷酸酶抑制剂混合物(100x) | Cwbiotech | CW2383S | |
| 180 kDa预染蛋白Marker | ThermoFisher | 26617 | |
| 一步法PAGE凝胶快速制备试剂盒 | EpiZyme | PG212 | |
| PVDF膜 | Merck millipore | ISEQ00010 | |
| 脱脂奶粉 | Biofroxx | 1172 | |
| 牛血清白蛋白 | Servicebio | GC305010 | |
| 5X SDS-PAGE电泳缓冲液 | Beyotime | P0286 | |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | Beyotime | C1006 |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Gempharmatech | -- |
| 抗体验证 | FITC抗人CD326 (EpCAM)抗体 | Biolegend | 369813 |
| APC抗人CD140a (PDGFRα)抗体 | Biolegend | 323511 | |
| FITC抗人CD45抗体 | 4A Biotech | FHF045-01 | |
| PE抗人CD31抗体 | 4A Biotech | FHP031-01 | |
| 流式分析 | APC抗人PD-L1 (B7-H1)抗体 | Proteintech | APC-65081 |
| Western blot | α-平滑肌肌动蛋白(D4K9N) XP®兔单抗 | Cell Signaling Technology | 19245 |
| 波形蛋白(D21H3) XP®兔单抗 | Cell Signaling Technology | 5741 | |
| 抗PDGFR alpha抗体 | Abcam | ab203491 | |
| 成纤维细胞活化蛋白α (FAP)兔单抗 | Abclonal | A11572 | |
| Akt (pan) (C67E7)兔单抗 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| 磷酸化Akt (Ser473) (D9E) XP®兔单抗 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 雄激素受体兔单抗 | Abclonal | A19611 | |
| PD-L1/CD274单克隆抗体 | Proteintech | 66248 | |
| GAPDH兔单抗 | Abclonal | A19056 | |
| 重组抗alpha微管蛋白抗体 | Servicebio | GB15201 | |
| 免疫组化 | 抗Ki67兔多抗 | Servicebio | GB111499 |
| 抗Cleaved-Caspase-3兔多抗 | Servicebio | GB11532 | |
| 中和抗体 | RANTES多克隆抗体 | Proteintech | 12000-1-AP |
| 人CCL5/RANTES抗体 | R&D | AF-278-SP | |
| 免疫荧光 | HyperFluor™ 488山羊抗兔IgG (H+L)抗体 | APExBIO | K1206 |
| FITC山羊抗小鼠IgG (H+L)抗体 | APExBIO | K1201 | |
| Cy3山羊抗小鼠IgG (H+L)抗体 | APExBIO | K1207 | |
| Western blot | HRP山羊抗兔IgG (H+L)抗体 | APExBIO | K1223 |
| 药物溶解 | PEG300 | Selleck Chemicals | S6704 |
| 吐温80 | Selleck Chemicals | S6702 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CAF和NF分离 | 组织来源、消化条件（胶原酶浓度、时间）、细胞传代次数 阅读提示：STAR Methods: Primary PCa specimens and isolation of primary fibroblasts |
| 体外细胞处理 | 细胞系、CAF-CM预处理时间、Enz浓度、CCL5浓度、MVC和MK-2206浓度 阅读提示：Figure legends 1-5 |
| 体内动物模型 | 小鼠品系、细胞接种数量及比例、给药剂量和方案、分组及样本量 阅读提示：STAR Methods: Animal studies and Figure 6 |
| 细胞功能检测 | 凋亡检测方法、CCK-8检测时间点 阅读提示：STAR Methods: Flow cytometric analysis and Cell survival analysis |
| 蛋白表达检测 | Western blot条件（抗体、蛋白上样量等） 阅读提示：STAR Methods: Western blot |