Elabela inhibits TRAF1/NF-κB induced oxidative DNA damage to promote diabetic foot ulcer wound healing.
包含体内动物模型（db/db小鼠全层皮肤缺损模型）、体外细胞实验（HUVECs高糖模型）、功能验证（迁移、血管生成）和机制验证（TRAF1/NF-κB通路），并有人类样本验证。
db/db小鼠全层皮肤缺损模型 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）高糖模型 糖尿病足溃疡患者创面组织
db/db小鼠和db/m小鼠来源及周龄（9周，雄性） ELA给药剂量（5 μg/g/d）和给药方式（创面周围多点皮下注射，隔日一次） HUVECs高糖建模浓度（30 mM葡萄糖）和ELA干预浓度（5 μM） TRAF1过表达质粒和si-APJ转染条件（Lipofectamine 3000，转染48-72小时） PMA（NF-κB激活剂）浓度（50 nM）和处理时间（24小时）
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ELA在糖尿病状态下对创面愈合的促进作用及其对炎症和DNA损伤的影响。
使用db/m和db/db小鼠构建全层皮肤缺损模型，db/db小鼠随机分为db/db组和db/db+ELA组（每组5只），创面周围多点皮下注射ELA（5 μg/g/d）或PBS，隔日一次，观察至第21天，检测创面闭合率、组织学改变、炎症因子（IL-6、TNF-α）和8-OHdG水平，以及CD31免疫组化染色。
确定ELA对高糖环境下内皮细胞增殖、迁移和血管生成能力的影响。
使用CCK-8检测不同葡萄糖浓度和ELA浓度下的细胞活力；采用划痕实验和Transwell实验检测迁移；Matrigel血管生成实验评估管形成能力。
识别ELA在高糖条件下调控的基因及涉及的信号通路。
对HUVECs在正常糖（BL）、高糖（HG）、高糖+ELA（ELA）条件下进行mRNA测序，筛选差异表达基因，进行GO和KEGG富集分析。
确定ELA是否减轻高糖诱导的ROS积累和氧化性DNA损伤。
使用荧光探针DCFH-DA检测ROS水平；彗星实验评估DNA损伤（尾DNA含量和OTM）；ELISA检测细胞培养上清中8-OHdG；Western blot检测p53和p21蛋白表达。
确定TRAF1和NF-κB信号是否是ELA保护效应的关键机制。
通过qPCR和Western blot检测TRAF1表达和NF-κB p65磷酸化水平；使用PMA激活NF-κB，观察对ELA保护作用的影响；通过TRAF1过表达质粒转染，评估对DNA损伤、凋亡和血管生成的影响。
确定ELA的保护作用是否通过其受体APJ介导。
使用siRNA沉默APJ（si-APJ），检测TRAF1表达、NF-κB磷酸化、DNA损伤、凋亡和迁移的变化。
验证TRAF1/p-NF-κB p65在人体DFU组织中的表达差异，评估临床相关性。
收集DFU患者和非糖尿病创伤患者创面组织，进行HE染色和Western blot检测TRAF1、p-NF-κB p65、NF-κB p65表达。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | Elabela | GL Biochem | 585575 |
| 药物处理 | 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | MedChemExpress | HY-18739 |
| 细胞培养 | ECM培养基 | ScienCell | -- |
| D-葡萄糖 | Sigma | -- | |
| Western blot | 兔抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4967 |
| 兔抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 兔抗磷酸化NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 兔抗NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 兔抗TRAF1抗体 | Cell Signaling Technology | 4715 | |
| 兔抗磷酸化IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 2859 | |
| 小鼠抗IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 9247 | |
| 兔抗p53抗体 | Cell Signaling Technology | 2527 | |
| 兔抗p21抗体 | Proteintech | 10335-1-AP | |
| 兔抗apelin受体抗体 | Proteintech | 20341-1-AP | |
| 兔抗TRAF1抗体 | Abcam | ab300076 | |
| 山羊抗兔IgG HRP连接抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 山羊抗小鼠IgG HRP连接抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| ELISA | 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-MSEL-M0001 |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-MSEL-M0002 | |
| 8-OHdG ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-0028c | |
| 细胞培养 | 人脐静脉内皮细胞 | iCell | h110 |
| 动物模型 | BKS-db小鼠（Lepr wt/wt） | TopBiotech Co., Ltd | IMSR_GPT:T002407 |
| BKS-db小鼠（Lepr KO/KO） | TopBiotech Co., Ltd | IMSR_NM-KO-190663 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000 |
| 质粒提取 | 质粒提取试剂盒 | Magen | P1114 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Sigma | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Merck Millipore | -- | |
| 转染 | HiPure质粒提取试剂盒 | Magen | -- |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂盒 | Tongren | -- |
| 细胞凋亡 | 凋亡检测试剂盒 | BD | -- |
| 血管生成实验 | 基质胶 | Corning | -- |
| 彗星实验 | Keygentec彗星试剂盒 | Keygentec | -- |
| 流式细胞术 | 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内动物模型 | 小鼠品系、周龄、性别；ELA剂量和给药方式；创面大小；观察时间点 阅读提示：详见STAR★Methods中“Construction and intervention of diabetic skin defect mouse model” |
| 细胞培养与处理 | HUVECs代次；高糖浓度（30 mM）；ELA浓度（5 μM）；处理时间（48小时） 阅读提示：详见STAR★Methods中“Cell lines and culture”及图2图例 |
| 机制验证 | TRAF1过表达质粒序列；si-APJ序列；转染试剂和浓度；PMA浓度和时间 阅读提示：详见STAR★Methods中“Plasmid, siRNA construction and transfection”和“Drugs”，及图4-6图例 |
| 临床样本 | DFU患者和对照组的样本量、年龄、性别匹配；组织处理方式 阅读提示：详见STAR★Methods中“Ethics, animals and human specimens”及图7图例 |
