HT-eY2H筛选人类宿主靶标
鉴定与Ece1肽（包括念珠菌素）直接相互作用的人类蛋白
使用HT-eY2H系统将Ece1肽与人类ORFeome文库共表达，通过选择性培养基筛选阳性相互作用，并进行Sanger测序确认。
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全球真菌-宿主相互作用组图谱揭示念珠菌素的宿主靶标
Global fungal-host interactome mapping identifies host targets of candidalysin.
实验完整度
高包含HT-eY2H筛选、体外细胞实验、机制验证（Co-IP、BIAcore、BiFC）、动物模型（口咽念珠菌病）等多个独立证据层级，并有功能及机制验证。
主要模型
HT-eY2H筛选系统 FaDu细胞 A549细胞 小鼠口咽念珠菌病模型
重点核对
肽段浓度：10 μM和20 μM candidalysin处理FaDu细胞4小时 细胞模型：FaDu、A549、CHO-K1、HEK-293T细胞系 动物模型：BALB/c小鼠，6-8周龄，雌性，口咽念珠菌病模型 关键菌株：白色念珠菌WT、ece1Δ/Δ、ece1Δ/Δ+ECE1、ece1Δ/Δ+ECE1Δ184-279 检测指标：γ-H2AX灶形成、CCNH表达、微核率、彗星实验
摘要
念珠菌素是由人类真菌病原体白色念珠菌分泌的一种溶细胞肽毒素，对真菌的致病性至关重要。然而，其胞内靶标尚未被广泛绘制。在这里，我们进行了高通量增强型酵母双杂交（HT-eY2H）筛选，以绘制所有八种Ece1肽与其直接人类蛋白靶标的相互作用组，并鉴定了一系列潜在相互作用蛋白，其中一些为多个肽所共有。CCNH是参与DNA损伤修复的CDK激活激酶（CAK）复合物的调节亚基，被鉴定为念珠菌素的宿主靶标之一。机制研究表明，念珠菌素触发显著增加的双链DNA断裂（DSBs），表现为γ-H2AX灶的形成以及CCNH与γ-H2AX的共定位。重要的是，念珠菌素直接结合CCNH以激活CAK，从而抑制DNA损伤修复通路。在念珠菌素处理下，CCNH的缺失减轻DSB的形成。在口咽念珠菌病小鼠模型中，念珠菌素编码基因的缺失未能诱导DSB并刺激CCNH上调。总的来说，我们的研究揭示了一种分泌型真菌毒素通过靶向CCNH劫持经典DNA损伤修复通路并促进真菌感染。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 念珠菌素是否通过靶向宿主蛋白来促进真菌感染？
- 核心机制
- 念珠菌素直接结合CCNH并激活CAK复合物，从而抑制DNA损伤修复通路，导致DSB积累和细胞损伤。
- 主要证据
- HT-eY2H筛选发现CCNH为靶标；Co-IP、BiFC和BIAcore验证直接结合；体外实验显示candidalysin诱导γ-H2AX形成并抑制修复；动物模型中ECE1缺失减少DSB和CCNH上调。
- 研究意义
- 揭示念珠菌素作为分泌型毒素通过劫持DNA修复机制促进感染，为抗真菌治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞损伤与DNA损伤评估
验证念珠菌素对上皮细胞的毒性及DNA损伤效应
用合成念珠菌素处理FaDu和A549细胞，检测LDH释放、细胞周期、微核形成、彗星实验和γ-H2AX免疫荧光。
机制验证：念珠菌素与CCNH的直接结合
确认念珠菌素直接与CCNH结合并激活CAK
通过Co-IP、BiFC、SPR（BIAcore）和分子对接验证结合，并检测CAK激酶活性和CDK磷酸化。
体内验证：口咽念珠菌病小鼠模型
验证念珠菌素在体内诱导DNA损伤并上调CCNH和γ-H2AX
用C. albicans菌株或念珠菌素感染小鼠，检测真菌载量、微核率、组织病理和免疫组化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证DNA损伤
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | F12K培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141 | |
| 青链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 谷氨酰胺补充剂 | Gibco | 35050061 | |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | Elabscience | E-CK-A351 |
| 细胞毒性检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Dojindo | CK12 |
| RNA提取 | RNA稳定保存液 | Beyotime | R0118-100ml |
| RNeasy小型RNA提取试剂盒 | Qiagen | 74106 | |
| RT-qPCR | PrimeScript™逆转录试剂盒 | Takara | RR037A |
| 2x SYBR Green定量PCR预混液 | Bimake | B21203 | |
| 伯乐CFX96热循环仪 | Biorad | -- | |
| Western blot | 细胞裂解液 | Beyotime | P0013 |
| Pierce™ BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 | |
| CCNH抗体 | CST | 2927 | |
| γ-H2AX抗体 | CST | 97185 | |
| GAPDH一抗 | CST | 5174S | |
| 抗磷酸化CDK2/CDK1抗体 | Abcam | EPR17621 | |
| 抗兔IgG二抗（HRP标记） | CST | 7074 | |
| DYKDDDDK标签抗体 | CST | 14793 | |
| GFP单抗 | CST | 2955 | |
| 抗鼠IgG二抗（HRP标记） | CST | 7076 | |
| SuperSignal™ West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Scientific | 34577 | |
| 化学发光成像分析系统 | Baygene | -- | |
| 微核试验 | 顺铂 | -- | -- |
| 彗星实验 | DAPI染色液 | Beyotime | C1002 |
| 免疫荧光 | 抗γ-H2AX（磷酸化S139）抗体 | Abcam | ab303656 |
| 山羊抗小鼠IgG二抗（Alexa Fluor 647） | Abcam | ab150115 | |
| 山羊抗兔IgG二抗（Alexa Fluor 488） | Abcam | ab150077 | |
| 含DAPI的抗淬灭封片剂 | Beyotime | P0131 | |
| 共免疫沉淀 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Scientific | L3000001 |
| RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B | |
| 磷酸酶抑制剂混合物D | Beyotime | P1096 | |
| GFP单抗磁珠偶联物 | CST | 67090 | |
| 小鼠IgG磁珠偶联物 | CST | 5873 | |
| 表面等离子体共振 | 重组Cyclin H蛋白 | Sino Biological | Lot. |
| Biacore T200仪器 | GE | -- | |
| CM5传感芯片 | GE | -- | |
| HBS-EP运行缓冲液 | GE | -- | |
| 胺偶联试剂盒 | GE | -- | |
| 人导管素 | Solarbio | CLP0454 | |
| 动物实验 | 醋酸可的松 | -- | -- |
| 细胞分离 | 吉姆萨染液 | Sigma | 1.09203 |
| 细胞活力检测 | Calcein/PI细胞活力/细胞毒性检测试剂盒 | DOJINDO | C542 |
| 细胞共培养 | Transwell细胞培养板 | Corning | 3450 |
| RNA-seq | Trizol试剂 | TIANGEN | DP424 |
| VAHTS Universal V6 RNA-seq文库制备试剂盒 | Vazyme | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 蛋白质印迹抗体封闭 | Cyclin H抗体 | CST | 2927 |
| 果蝇感染 | Nanoject II自动纳升注射器 | Drummond | -- |
| 免疫共沉淀 | EcoRI限制性内切酶 | Thermo Scientific | FD0583 |
| KpnI限制性内切酶 | Thermo Scientific | FD0504 | |
| HindIII限制性内切酶 | Thermo Scientific | FD0584 | |
| XbaI限制性内切酶 | Thermo Scientific | FD0503 | |
| 分子克隆 | 高保真DNA聚合酶 | -- | 60070E |
| 大肠杆菌DH5α感受态细胞 | TIANGEN | CB101 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HT-eY2H筛选 | 酵母菌株Y8930和Y8800，筛选培养基类型，CHX敏感性 阅读提示：Methods: High-throughput enhanced yeast two-hybrid assay |
| 细胞损伤实验 | 细胞系（FaDu、A549）培养条件，candidalysin浓度（5-80 μM），处理时间（4或12小时） 阅读提示：Methods: Cell lines, LDH cytotoxicity assay |
| DNA损伤检测 | candidalysin浓度（10 μM），处理时间（4小时），细胞类型（FaDu） 阅读提示：Figure 4c-e and Methods: Micronucleus test, Comet assay |
| 机制验证 | CCNH蛋白浓度（20 μg/mL），candidalysin浓度系列（0-250 nM），SPR条件（温度25°C，流速30 μL/min） 阅读提示：Methods: Surface plasmon resonance (SPR) measurement on BIAcore |
| 体内实验 | 小鼠品系（BALB/c，雌性，6-8周龄），感染菌株浓度（107 CFU/mL），candidalysin浓度（70 μM），感染时间（5天），皮质酮剂量（225 mg/kg） 阅读提示：Methods: Mouse strains, The murine model of oropharyngeal candidiasis |