基于岩藻多糖复合物的功能性饮料通过延缓增殖、细胞周期和上皮-间质转化信号通路发挥抗结直肠癌作用

Anti-Colorectal Cancer Effects of Fucoidan Complex-Based Functional Beverage Through Retarding Proliferation, Cell Cycle and Epithelial-Mesenchymal Transition Signaling Pathways.

作者信息Chun-Hao Chan, Yue-Hua Deng, Bou-Yue Peng, Pao-Chang Chiang, Li-An Wu, Yen-Yung Lee, Wen Tsao, Hsiang-Hsun Mao, Chia-Yu Wu, Win-Ping Deng
PMID38059303
发布时间2023-01-22
DOI10.1177/15347354231213613

实验完整度

包含体外细胞实验(增殖、迁移、凋亡)、体内小鼠模型及安全性评估,并进行了基因和蛋白水平的机制验证。

主要模型

人结直肠癌细胞系HT-29、SW480、SW620 NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型(HT-29细胞)

重点核对

VMW-FC处理浓度:0、2、4 mg/ml 细胞处理时间:48小时 动物模型:NOD/SCID小鼠皮下接种HT-29细胞(1×10^6) 动物给药剂量:960 mg/kg/day,口服灌胃 统计方法:单因素方差分析、双因素方差分析、学生t检验

摘要

背景:源自墨角藻的岩藻多糖是一种来源于海洋生物的多功能生物活性多糖,具有广泛的治疗特性,包括抗肿瘤作用。虽然先前的研究已报道其抗癌潜力,但有限的研究探索了其与其他天然生物活性成分组合时的协同能力。在本研究中,我们开发了一种综合性功能性饮料,命名为VMW-FC,由岩藻多糖复合物(FC)以及多种草本成分的混合物组成,包括蔬菜(V)、桑葚和水果(M)以及斯佩耳特小麦(W)。目的:结直肠癌(CRC)仍然是导致死亡的重要原因,尤其是在转移性病例中。因此,迫切需要能够全面抑制CRC的新型替代药物。在本研究中,我们评估了VMW-FC对CRC细胞增殖、细胞周期动力学、转移、体内肿瘤形成以及潜在副作用的影响。方法:使用MTT和集落形成实验评估细胞生长,通过伤口愈合和transwell迁移实验评估转移潜能。通过qPCR和western blot阐明潜在的信号机制。使用皮下荷瘤NOD/SCID小鼠模型评估体内肿瘤形成和潜在副作用。结果:我们的发现表明,VMW-FC以剂量和时间依赖性方式显著阻止CRC增殖和迁移。此外,通过流式细胞术分析证实,它诱导亚G1期细胞周期阻滞和凋亡细胞群体的增加。值得注意的是,VMW-FC还抑制NOD/SCID小鼠的异种移植肿瘤生长,且不引起肾或肝毒性。结论:综合草药制剂VMW-FC通过减缓增殖和迁移、诱导细胞周期阻滞和凋亡,以及抑制与增殖(Ki-67、PCNA和CDKs)和上皮-间质转化(EMT)(Vimentin、N-cadherin和β-catenin)相关的标志物,为抑制CRC提供了一种有前景的方法。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
VMW-FC能否抑制结直肠癌的生长和转移,其潜在机制是什么?
核心机制
VMW-FC通过抑制增殖和细胞周期相关蛋白(如CDKs、cyclins)、诱导凋亡(调节Bcl-2/Bax)、以及抑制EMT标志物(如vimentin、N-cadherin、β-catenin)来发挥抗CRC作用。
主要证据
体外实验(MTT、集落形成、伤口愈合、transwell)显示VMW-FC以剂量和时间依赖性方式抑制CRC细胞增殖和迁移;流式细胞术显示诱导亚G1期阻滞和凋亡;体内实验显示VMW-FC抑制HT-29异种移植肿瘤生长且无肝肾毒性。
研究意义
VMW-FC作为一种新型综合草药疗法,为结直肠癌的治疗提供了有前景的替代方案。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

细胞增殖和活力评估

评估VMW-FC对CRC细胞生长和活力的影响

使用HT-29、SW480和SW620细胞系,进行细胞计数、MTT和集落形成实验,处理浓度为0、2、4 mg/ml,处理48小时(集落形成实验为2周)。

2

细胞迁移能力评估

评估VMW-FC对CRC细胞迁移能力的影响

通过伤口愈合和transwell迁移实验检测处理后的细胞迁移能力。

3

细胞周期和凋亡分析

评估VMW-FC对CRC细胞周期分布和凋亡的影响

通过流式细胞术进行细胞周期分析和Annexin V-PE/7-AAD双染凋亡检测。

4

信号通路机制分析

阐明VMW-FC调控的增殖、细胞周期、凋亡和EMT相关基因和蛋白表达

通过qPCR检测基因表达,Western blot检测蛋白表达。

5

体内抗肿瘤效果评估

评估VMW-FC对体内肿瘤生长的抑制作用及其安全性

使用NOD/SCID小鼠皮下接种HT-29细胞,待肿瘤体积达100±30 mm³后,每日口服灌胃VMW-FC(500 µl,浓度对应960 mg/kg/day),测量肿瘤体积,并进行肝肾组织的H&E染色。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
RPMI-1640培养基Gibco23400-021
胎牛血清Corning35-010-CV
抗生素-抗真菌溶液Corning30-004-CI
甲基噻唑基二苯基四唑溴化物Sigma-AldrichM5655
二甲基亚砜Sigma-AldrichD5879
福尔马林MacronH121-08
结晶紫Fisher ScientificC581-25
乙酸Merck695092
乙醇Honeywell32221
核糖核酸酶ASigma-Aldrich10109142001
碘化丙啶Sigma-Aldrich11348639001
细胞过滤器Falcon352340
Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒ElabscienceE-CK-A216
总RNA小量提取试剂盒GeneaidRB050
RevertAid H minus第一链cDNA合成试剂盒Thermo scientificK1632
RIPA裂解液MilliporeCA92590
PVDF膜Merck MilliporeIPVH00010
牛血清白蛋白CytivaSH30574.02
细胞周期蛋白A2抗体Cell Signaling Technology4656
细胞周期蛋白B1抗体Cell Signaling Technology12231
细胞周期蛋白D1抗体Cell Signaling Technology2978
CDK2抗体Cell Signaling Technology2546
CDK4抗体Cell Signaling Technology2546
CDK6抗体Cell Signaling Technology13331
波形蛋白抗体Cell Signaling Technology3932
N-钙黏蛋白抗体Cell Signaling Technology13116
E-钙黏蛋白抗体Cell Signaling Technology4065
β-连环蛋白抗体Cell Signaling Technology8480
β-肌动蛋白抗体MilliporeMAB1501
抗兔IgG二抗Cell Signaling Technology7074
抗小鼠IgG二抗Cell Signaling Technology7076
增强化学发光试剂盒BionovasFL0010-0170

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
细胞系来源、培养基、血清和抗生素浓度
阅读提示:Materials and Methods - Cell Culture
细胞活力检测
细胞接种密度、VMW-FC浓度、处理时间、MTT孵育时间、测量波长
阅读提示:Materials and Methods - Cell Viability
集落形成实验
细胞接种密度、VMW-FC浓度、处理时间、培养基更换频率、染色和计数方法
阅读提示:Materials and Methods - Colony Formation Assay
迁移实验
细胞接种密度、VMW-FC浓度、处理时间、伤口愈合实验的观察时间点、transwell实验的孵育时间
阅读提示:Materials and Methods - Wound-Healing Assay 和 Transwell Migration Assays
细胞周期和凋亡分析
VMW-FC浓度、处理时间、染色步骤、流式细胞仪设置
阅读提示:Materials and Methods - Cell Cycle Analysis 和 Apoptosis Detection
qPCR
RNA提取方法、cDNA合成、引物序列、定量方法
阅读提示:Materials and Methods - Real-Time Polymerase Chain Reaction (qPCR)
Western blot
裂解液、蛋白上样量、抗体稀释度、检测方法
阅读提示:Materials and Methods - Western Blot
动物实验
小鼠品系、性别、年龄、接种细胞数和部位、给药剂量和方式、肿瘤测量方法、伦理批准号
阅读提示:Materials and Methods - Animal Studies