从普洱茶中分离的茶褐素通过TLR2/4介导的信号通路增强RAW264.7巨噬细胞的先天免疫和抗炎作用

Theabrownin Isolated from Pu-Erh Tea Enhances the Innate Immune and Anti-Inflammatory Effects of RAW264.7 Macrophages via the TLR2/4-Mediated Signaling Pathway.

作者信息Lei Zhao, Yue Miao, Bo Shan, Chunyan Zhao, Chunxiu Peng, Jiashun Gong
PMID37048289
期刊Foods
发布时间2023-03-30
DOI10.3390/foods12071468

实验完整度

以RAW264.7细胞为模型,包含体外功能实验(增殖、吞噬、细胞因子分泌)、Western blot机制研究和转录组分析,但缺乏体内实验验证。

主要模型

RAW264.7小鼠巨噬细胞系

重点核对

TB浓度62.5、125、250、500 μg/mL及LPS 1 μg/mL处理 细胞培养条件:DMEM含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素,37°C,5% CO2 TLR2/4抗体阻断实验(anti-TLR2、anti-TLR4及联合处理) 检测指标:NO、TNF-α、IL-6、IL-1β分泌及iNOs、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表达

摘要

茶褐素(TB)是一种从普洱茶中提取的茶色素。TB对先天免疫和炎症的影响尚不清楚。在此,使用RAW264.7巨噬细胞研究TB对先天免疫的影响。我们发现,TB促进了RAW264.7巨噬细胞的增殖,改变了它们的形态,增强了它们的胞饮和吞噬能力,并显著增加了它们的一氧化氮(NO)和细胞因子的分泌,所有这些都增强了免疫反应。此外,TB抑制了经脂多糖(LPS)预刺激的RAW264.7巨噬细胞中炎症信号的释放,表明TB调节了细菌感染引起的过度炎症。Western blot显示,TB可以激活Toll样受体(TLR)2/4介导的髓样分化因子88(MyD88)依赖性丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子-κB(NF-κB)信号通路,以及TLR2介导的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT信号通路,增强RAW264.7巨噬细胞的免疫功能。TB还抑制了LPS诱导的MAPK/NF-κB/PI3K-AKT信号通路核心蛋白的磷酸化。此外,我们分析了RAW264.7巨噬细胞的转录组,京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析显示TB调节了Toll样受体信号通路。基因本体(GO)富集分析表明,TB处理强烈调节了免疫反应和炎症。因此,TB通过TLR2/4信号通路增强先天免疫并调节炎症。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
茶褐素(TB)对RAW264.7巨噬细胞先天免疫和炎症的调节作用及其潜在机制是什么?
核心机制
TB通过结合TLR2和TLR4,激活MyD88依赖性MAPK和NF-κB信号通路,并通过TLR2激活PI3K-AKT信号通路,增强先天免疫;同时通过负调控TLR2/4介导的MAPK/NF-κB/PI3K-AKT通路抑制LPS诱导的过度炎症。
主要证据
RAW264.7细胞实验显示,TB促进增殖、吞噬和细胞因子分泌;Western blot显示TB上调TLR2/4、MyD88及关键蛋白磷酸化,抑制LPS诱导的磷酸化;转录组分析显示TB调节免疫和炎症相关通路。
研究意义
TB有望作为具有免疫调节和抗炎特性的功能食品和药物补充剂。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

细胞活力测定

评估不同浓度TB对RAW264.7细胞增殖的影响,确定后续实验浓度。

用不同浓度TB(62.5-1500 μg/mL)处理RAW264.7细胞24或48小时,CCK-8法检测OD450。

2

形态学观察

观察TB对巨噬细胞形态的影响,以及TB对LPS诱导形态改变的调节。

细胞培养于60 mm培养板,TB处理或TB预处理后加LPS,使用倒置显微镜观察形态。

3

吞噬和胞饮能力测定

检测TB对巨噬细胞吞噬大分子(FITC-大肠杆菌)和胞饮小分子(中性红)能力的影响。

细胞用TB或LPS处理8小时,分别加入中性红或FITC-大肠杆菌,通过荧光或吸收测定。

4

NO和细胞因子分泌及mRNA表达检测

评估TB对RAW264.7细胞NO和细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)分泌及其mRNA表达的影响,并检测TB对LPS诱导的炎症的抑制作用。

用TB或LPS处理细胞,Griess试剂检测NO,ELISA检测细胞因子,RT-qPCR检测mRNA表达。

5

TLR2/4抗体阻断实验

验证TB是否通过TLR2和TLR4发挥作用。

细胞先用anti-TLR2、anti-TLR4或两者联合预处理2小时,再加入TB处理8小时,检测细胞因子分泌。

6

Western blot检测信号通路

验证TB对TLR2/4介导的MAPK、NF-κB和PI3K-AKT信号通路关键蛋白表达及磷酸化的影响,及对LPS诱导激活的抑制。

收集细胞蛋白,Western blot检测TLR2、TLR4、MyD88、p-p38、p-JNK、p-ERK、p-p65、p-IκBα、p-AKT等。

7

转录组测序及分析

分析TB对RAW264.7细胞转录组的影响,富集免疫和炎症相关通路。

提取RNA进行mRNA-seq,进行PCA、差异基因分析、KEGG和GO富集分析。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

检测细胞活力与增殖
检测细胞因子与NO分泌
验证基因表达变化
验证蛋白表达与磷酸化

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基Biological Industries01-052-1A
胎牛血清Biological Industries04-001-1A
青霉素和链霉素Biological Industries03-033-1B
脂多糖SolarbioL8880
CCK-8试剂盒Proteintech GroupPF00004
中性红SolarbioN8160
Vybrant吞噬检测试剂盒Thermo Fisher ScientificV6694
TNF-α ELISA试剂盒Elabscience BiotechnologyE-EL-M3063
IL-1β ELISA试剂盒Elabscience BiotechnologyE-EL-M0037c
IL-6 ELISA试剂盒Elabscience BiotechnologyE-EL-M0044c
Griess试剂盒Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA013-2-1
TRNzol Universal试剂TianGenDP424
FastKing反转录试剂盒(含gDNase)TianGenKR116
FastKing一步法RT-qPCR SYBR Green试剂盒TianGenFP313
PVDF膜Immobilon-P (Merck KGaA)0.45 μm
脱脂奶粉BD Biosciences--
ECL化学发光试剂盒BiosharpBL520A
BCA蛋白定量试剂盒BiosharpBL521A
RIPA裂解液SolarbioR0010
牛血清白蛋白SolarbioA8020
TBST缓冲液SolarbioT1082
抗TLR2抗体Cell Signaling Technology2229S
抗TLR4抗体Cell Signaling Technology14358S
抗磷酸化p38抗体Cell Signaling Technology4511T
抗磷酸化JNK抗体Cell Signaling Technology4668T
抗磷酸化ERK抗体Cell Signaling Technology4370T
抗TLR4抗体Proteintech Group66350-1-Ig
抗MyD88抗体Proteintech Group67969-1-Ig
抗p38抗体Proteintech Group66234-1-Ig
抗JNK抗体Proteintech Group66210-1-Ig
抗ERK抗体Proteintech Group11257-1-AP
抗p65抗体Proteintech Group10745-1-AP
抗IκBα抗体Proteintech Group10268-1-AP
抗β-actin抗体Proteintech Group66009-1-Ig
抗AKT抗体ABclonalA11016
抗磷酸化p65抗体ABclonalAP0123
抗磷酸化AKT抗体ABclonalAP0140
抗磷酸化IκBα抗体Affinity BiosciencesAF2002
预染蛋白markerProteintech GroupPL00001
二抗Proteintech Group--
RAW264.7细胞Kunming Institute of Zoology--
酶标仪Thermo Fisher--
倒置显微镜Leica--
荧光显微镜Leica--
荧光酶标仪Bio-tek--
ABI StepOne Plus实时荧光定量PCR仪Applied Biosystems Inc.--
ChemiDoc Touch成像系统Bio-rad--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
细胞系来源、培养基成分、血清浓度、抗生素浓度、培养温度、CO2浓度、传代密度和代数
阅读提示:见Methods 2.3
细胞活力测定
TB浓度系列、处理时间、CCK-8孵育时间、检测波长
阅读提示:见Methods 2.4
形态学观察
TB浓度、LPS浓度、处理时间、预处理时间
阅读提示:见Methods 2.5
吞噬和胞饮能力测定
中性红浓度和孵育时间、FITC-大肠杆菌孵育时间、PBS洗涤步骤、乙酸乙醇溶液浓度、检测波长
阅读提示:见Methods 2.6
NO和细胞因子检测
Griess试剂盒使用步骤、ELISA试剂盒型号、标准曲线建立、mRNA表达检测的引物序列和PCR条件
阅读提示:见Methods 2.7、2.8
TLR2/4抗体阻断实验
抗体浓度、预处理时间、TB浓度和处理时间
阅读提示:见Methods 2.9
Western blot分析
RIPA裂解液、蛋白上样量、SDS-PAGE胶浓度、转膜条件、封闭条件、一抗二抗浓度及孵育时间
阅读提示:见Methods 2.10
转录组测序
RNA提取方法、测序平台、样本数量、差异基因筛选标准
阅读提示:见Methods 2.11