细胞活力测定
评估不同浓度TB对RAW264.7细胞增殖的影响,确定后续实验浓度。
用不同浓度TB(62.5-1500 μg/mL)处理RAW264.7细胞24或48小时,CCK-8法检测OD450。
Theabrownin Isolated from Pu-Erh Tea Enhances the Innate Immune and Anti-Inflammatory Effects of RAW264.7 Macrophages via the TLR2/4-Mediated Signaling Pathway.
以RAW264.7细胞为模型,包含体外功能实验(增殖、吞噬、细胞因子分泌)、Western blot机制研究和转录组分析,但缺乏体内实验验证。
RAW264.7小鼠巨噬细胞系
TB浓度62.5、125、250、500 μg/mL及LPS 1 μg/mL处理 细胞培养条件:DMEM含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素,37°C,5% CO2 TLR2/4抗体阻断实验(anti-TLR2、anti-TLR4及联合处理) 检测指标:NO、TNF-α、IL-6、IL-1β分泌及iNOs、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表达
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估不同浓度TB对RAW264.7细胞增殖的影响,确定后续实验浓度。
用不同浓度TB(62.5-1500 μg/mL)处理RAW264.7细胞24或48小时,CCK-8法检测OD450。
观察TB对巨噬细胞形态的影响,以及TB对LPS诱导形态改变的调节。
细胞培养于60 mm培养板,TB处理或TB预处理后加LPS,使用倒置显微镜观察形态。
检测TB对巨噬细胞吞噬大分子(FITC-大肠杆菌)和胞饮小分子(中性红)能力的影响。
细胞用TB或LPS处理8小时,分别加入中性红或FITC-大肠杆菌,通过荧光或吸收测定。
评估TB对RAW264.7细胞NO和细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)分泌及其mRNA表达的影响,并检测TB对LPS诱导的炎症的抑制作用。
用TB或LPS处理细胞,Griess试剂检测NO,ELISA检测细胞因子,RT-qPCR检测mRNA表达。
验证TB是否通过TLR2和TLR4发挥作用。
细胞先用anti-TLR2、anti-TLR4或两者联合预处理2小时,再加入TB处理8小时,检测细胞因子分泌。
验证TB对TLR2/4介导的MAPK、NF-κB和PI3K-AKT信号通路关键蛋白表达及磷酸化的影响,及对LPS诱导激活的抑制。
收集细胞蛋白,Western blot检测TLR2、TLR4、MyD88、p-p38、p-JNK、p-ERK、p-p65、p-IκBα、p-AKT等。
分析TB对RAW264.7细胞转录组的影响,富集免疫和炎症相关通路。
提取RNA进行mRNA-seq,进行PCA、差异基因分析、KEGG和GO富集分析。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Biological Industries | 01-052-1A |
| 胎牛血清 | Biological Industries | 04-001-1A | |
| 青霉素和链霉素 | Biological Industries | 03-033-1B | |
| 药物处理 | 脂多糖 | Solarbio | L8880 |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Proteintech Group | PF00004 |
| 胞饮能力检测 | 中性红 | Solarbio | N8160 |
| 吞噬能力检测 | Vybrant吞噬检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | V6694 |
| 细胞因子检测 | TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology | E-EL-M3063 |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology | E-EL-M0037c | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology | E-EL-M0044c | |
| NO检测 | Griess试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A013-2-1 |
| RNA提取 | TRNzol Universal试剂 | TianGen | DP424 |
| RT-qPCR | FastKing反转录试剂盒(含gDNase) | TianGen | KR116 |
| FastKing一步法RT-qPCR SYBR Green试剂盒 | TianGen | FP313 | |
| Western blot | PVDF膜 | Immobilon-P (Merck KGaA) | 0.45 μm |
| 脱脂奶粉 | BD Biosciences | -- | |
| ECL化学发光试剂盒 | Biosharp | BL520A | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Biosharp | BL521A |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| Western blot | 牛血清白蛋白 | Solarbio | A8020 |
| TBST缓冲液 | Solarbio | T1082 | |
| 抗TLR2抗体 | Cell Signaling Technology | 2229S | |
| 抗TLR4抗体 | Cell Signaling Technology | 14358S | |
| 抗磷酸化p38抗体 | Cell Signaling Technology | 4511T | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 4668T | |
| 抗磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370T | |
| 抗TLR4抗体 | Proteintech Group | 66350-1-Ig | |
| 抗MyD88抗体 | Proteintech Group | 67969-1-Ig | |
| 抗p38抗体 | Proteintech Group | 66234-1-Ig | |
| 抗JNK抗体 | Proteintech Group | 66210-1-Ig | |
| 抗ERK抗体 | Proteintech Group | 11257-1-AP | |
| 抗p65抗体 | Proteintech Group | 10745-1-AP | |
| 抗IκBα抗体 | Proteintech Group | 10268-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech Group | 66009-1-Ig | |
| 抗AKT抗体 | ABclonal | A11016 | |
| 抗磷酸化p65抗体 | ABclonal | AP0123 | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | ABclonal | AP0140 | |
| 抗磷酸化IκBα抗体 | Affinity Biosciences | AF2002 | |
| 预染蛋白marker | Proteintech Group | PL00001 | |
| 二抗 | Proteintech Group | -- | |
| 细胞培养 | RAW264.7细胞 | Kunming Institute of Zoology | -- |
| 细胞活力检测 | 酶标仪 | Thermo Fisher | -- |
| 形态学观察 | 倒置显微镜 | Leica | -- |
| 吞噬能力检测 | 荧光显微镜 | Leica | -- |
| 荧光酶标仪 | Bio-tek | -- | |
| RT-qPCR | ABI StepOne Plus实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems Inc. | -- |
| Western blot | ChemiDoc Touch成像系统 | Bio-rad | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基成分、血清浓度、抗生素浓度、培养温度、CO2浓度、传代密度和代数 阅读提示:见Methods 2.3 |
| 细胞活力测定 | TB浓度系列、处理时间、CCK-8孵育时间、检测波长 阅读提示:见Methods 2.4 |
| 形态学观察 | TB浓度、LPS浓度、处理时间、预处理时间 阅读提示:见Methods 2.5 |
| 吞噬和胞饮能力测定 | 中性红浓度和孵育时间、FITC-大肠杆菌孵育时间、PBS洗涤步骤、乙酸乙醇溶液浓度、检测波长 阅读提示:见Methods 2.6 |
| NO和细胞因子检测 | Griess试剂盒使用步骤、ELISA试剂盒型号、标准曲线建立、mRNA表达检测的引物序列和PCR条件 阅读提示:见Methods 2.7、2.8 |
| TLR2/4抗体阻断实验 | 抗体浓度、预处理时间、TB浓度和处理时间 阅读提示:见Methods 2.9 |
| Western blot分析 | RIPA裂解液、蛋白上样量、SDS-PAGE胶浓度、转膜条件、封闭条件、一抗二抗浓度及孵育时间 阅读提示:见Methods 2.10 |
| 转录组测序 | RNA提取方法、测序平台、样本数量、差异基因筛选标准 阅读提示:见Methods 2.11 |