细胞活力检测
评估GBE对BV-2和U87细胞活力的影响，确定后续实验浓度。
使用CCK-8试剂盒检测不同浓度GBE（5-100 µg/ml）及LPS处理对细胞活力的影响。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
MiR-146b-5p/TRAF6轴对银杏叶提取物GBE减轻LPS诱导的神经炎症至关重要
MiR-146b-5p/TRAF6 axis is essential for Ginkgo biloba L. extract GBE to attenuate LPS-induced neuroinflammation.
实验完整度
高实验涉及细胞模型（BV-2、U87、293T）上的功能验证（ELISA、western blot）和机制验证（双荧光素酶、基因突变、免疫荧光），以及生物信息学筛选，证据层级较完整。
主要模型
LPS诱导的BV-2小胶质细胞 LPS诱导的U87星形胶质细胞 293T细胞
重点核对
GBE处理浓度（25和50 µg/ml）及预处理时间（1小时） LPS刺激浓度（0.1 µg/ml）及处理时间（24小时） miR-146b-5p mimic/inhibitor转染及过表达/敲低效果 TRAF6 3'UTR野生型/突变型双荧光素酶报告基因验证靶向关系 NF-κB p65/p50核转位和DNA结合活性检测
摘要
背景：神经炎症在各种神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病）的发病和进展中起着关键作用。银杏叶提取物（GBE）已被广泛用于治疗脑和外周血液循环障碍。然而，其关于神经炎症的潜在靶点和潜在机制尚未被阐明。目的：本研究旨在研究和验证GBE对脂多糖（LPS）介导的炎症的抗神经炎症特性，并确定其潜在分子机制。方法：使用ELISA和western blot检测GBE对LPS诱导的炎性细胞因子释放的影响。通过荧光素酶、链霉亲和素-琼脂糖沉降和免疫荧光试验测定GBE对NF-κB结合活性和转位的影响。从GEO和microRNA数据库中筛选GBE的潜在靶点，并通过qPCR、荧光素酶、基因突变和western blot试验进一步鉴定。结果：GBE显著抑制LPS诱导的BV-2和U87细胞中的促炎反应，且无明显细胞毒性。GBE显著诱导miR-146b-5p表达，miR-146b-5p通过靶向其3′-UTR负调控TRAF6表达。因此，由于TRAF6抑制，GBE降低NF-κB的转录活性和促炎细胞因子（如白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α和环氧合酶（COX）-2）的表达，并最终逆转LPS诱导的神经炎症。结论：我们的研究揭示了GBE通过miR-146b-5p/TRAF6轴的抗神经炎症机制，并为其合理的临床应用提供了理论基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- GBE是否能减轻LPS诱导的神经炎症，以及其潜在分子机制是什么？
- 核心机制
- GBE通过上调miR-146b-5p表达，miR-146b-5p直接结合TRAF6的3'-UTR抑制其表达，从而抑制NF-κB信号通路，减少促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2）的产生，最终减轻神经炎症。
- 主要证据
- 在LPS诱导的BV-2和U87细胞中，GBE处理抑制炎症因子释放；qPCR和双荧光素酶实验证实GBE上调miR-146b-5p，miR-146b-5p靶向TRAF6 3'-UTR；miR-146b-5p抑制剂逆转GBE的抗炎作用。
- 研究意义
- 首次阐明GBE通过miR-146b-5p/TRAF6轴发挥抗神经炎症作用的机制，为其防治神经退行性疾病提供理论基础，并提出了基于miR-146b-5p/TRAF6的药物筛选系统。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
炎症因子释放检测
验证GBE对LPS诱导的促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）释放的影响。
细胞经GBE和LPS处理后，收集上清，用ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。
炎症蛋白表达检测
检测GBE对LPS诱导的炎性蛋白（TNF-α、IL-6、COX-2）表达的影响。
使用western blot分析BV-2细胞中TNF-α、IL-6和COX-2的蛋白表达。
NF-κB活性检测
评估GBE对LPS诱导的NF-κB转录活性的影响。
293T细胞共转染pNFκB-luc和Renilla荧光素酶报告质粒，经GBE和LPS处理后测定荧光素酶活性。
NF-κB信号通路蛋白磷酸化检测
检测GBE对LPS诱导的NF-κB信号通路关键蛋白磷酸化的影响。
western blot检测p-p65、p-IκBα和IκBα的水平。
NF-κB DNA结合活性检测
评估GBE对NF-κB与COX-2启动子结合活性的影响。
使用链霉亲和素-琼脂糖沉降实验检测NF-κB p50/p65与生物素标记的COX-2启动子探针的结合。
NF-κB核转位检测
验证GBE对LPS诱导的NF-κB p65/p50核转位的影响。
通过免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察p65和p50的亚细胞定位。
miR-146b-5p表达检测
筛选并验证GBE调控的潜在miRNA靶点。
通过GEO数据库筛选与GBE和AD相关的差异表达miRNA，并使用qPCR验证U87细胞中miR-146b-5p、miR-31-3p和miR-495-3p的表达。
miR-146b-5p功能验证
验证miR-146b-5p过表达或抑制对炎症反应的影响。
转染miR-146b-5p mimic或inhibitor，检测LPS诱导的IL-6和IL-1β表达以及NF-κB荧光素酶活性。
miR-146b-5p靶基因验证
验证miR-146b-5p是否直接靶向TRAF6的3'-UTR。
使用双荧光素酶报告基因实验，将TRAF6野生型或突变型3'-UTR报告质粒与miR-146b-5p mimic或inhibitor共转染293T细胞，检测荧光素酶活性；同时检测U87细胞中TRAF6 mRNA和蛋白水平的表达。
GBE对TRAF6表达的影响
验证GBE是否通过miR-146b-5p抑制TRAF6表达。
U87细胞经GBE和LPS处理，检测TRAF6 mRNA和蛋白表达；并用miR-146b-5p抑制剂验证其逆转作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
检测细胞因子释放
检测蛋白表达
检测细胞活力
检测转录活性
检测DNA-蛋白质结合
检测蛋白质定位
检测基因表达
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 银杏叶提取物注射液 | Youcare Pharmaceutical Group | H20070226 |
| 脂多糖 | Sigma | L2880 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞计数试剂盒 | -- | -- |
| ELISA | ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| Western blot | COX-2抗体 | Cell Signaling Technology | 4842 |
| IκB-α抗体 | Cell Signaling Technology | 4814 | |
| p-IκB-α抗体 | Cell Signaling Technology | 2859 | |
| NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| p-p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| NF-κB p50抗体 | Cell Signaling Technology | 13586 | |
| TNF-α抗体 | Proteintech | 60291-1-Ig | |
| IL-6抗体 | Proteintech | 21865-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Lamin B1抗体 | Proteintech | 12987-1-AP | |
| 双荧光素酶报告基因 | pNFκB-luc质粒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| 细胞转染 | miR-146b-5p模拟物 | General Biological System | -- |
| miR-146b-5p抑制剂 | General Biological System | -- | |
| 链霉亲和素-琼脂糖沉降 | 链霉亲和素偶联琼脂糖珠 | -- | -- |
| 免疫荧光 | FITC标记二抗 | -- | SA00003-1 |
| 罗丹明标记二抗 | -- | SA00007-2 | |
| DAPI | -- | -- | |
| Leica DM14000B共聚焦显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | BV-2和U87细胞的培养条件（DMEM+10% FBS+1%青霉素/链霉素），GBE预处理浓度（25和50 µg/ml）和时间（1小时），LPS浓度（0.1 µg/ml）和处理时间（24小时）。 阅读提示：见Materials and methods中的Cell culture and treatment |
| 细胞活力检测 | 细胞接种密度（5×10³细胞/96孔），GBE浓度范围（5-100 µg/ml），LPS浓度（0.1 µg/ml），处理时间（24小时），CCK-8添加量（10 μl），检测波长（450 nm）。 阅读提示：见Materials and methods中的Cell viability assay |
| 细胞因子释放检测 | GBE预处理浓度（0, 25, 50 µg/ml），LPS浓度（0.1 µg/ml），处理时间（24小时），上清收集和离心条件（1500 × g, 10分钟，4°C），ELISA试剂盒来源（Elabscience）。 阅读提示：见Materials and methods中的Determination of the release of TNF-α, IL-1β, and IL-6 |
| Western blot | 蛋白上样量（30-50 μg），SDS-PAGE凝胶浓度（10-12%），抗体稀释比例（如1:1000），内参蛋白（β-actin或GAPDH）。 阅读提示：见Materials and methods中的Western blot analysis及图例 |
| 双荧光素酶报告基因 | 293T细胞接种于六孔板，转染质粒（pNFκB-luc和Renilla），转染试剂Lipofectamine 2000，GBE处理浓度（25和50 µg/ml），LPS浓度（0.1 µg/ml），处理时间（GBE预处理1小时，LPS处理24小时）。 阅读提示：见Materials and methods中的Dual-luciferase reporter assay |
| 细胞转染 | miR-146b-5p mimic/inhibitor及其对照来源（General Biological System），转染试剂Lipofectamine 2000，转染时细胞融合度约70%，转染后培养时间（24小时）。 阅读提示：见Materials and methods中的Cell transfection assay |
| 链霉亲和素-琼脂糖沉降 | 核提取蛋白量（400 μg），生物素标记探针（COX-2启动子-20 nt至-498 nt）用量（4 μg），4%链霉亲和素琼脂糖珠用量（40 μl），PBSi缓冲液组成（含1 mM EDTA, 1 mM DTT, 蛋白酶抑制剂），孵育条件（室温25°C，5小时，旋转摇床）。 阅读提示：见Materials and methods中的Detection of DNA/protein binding via streptavidin-agarose pulldown assay |
| 免疫荧光 | 细胞在chamber slides中培养，固定和透化（4%多聚甲醛和0.2% TritonX-100），一抗（p65, p50）孵育条件（4°C过夜），二抗稀释比例（1:50），DAPI染色，显微镜型号（Leica DM14000B）。 阅读提示：见Materials and methods中的Confocal immunofluorescence |